Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

Zusammenfassung

T-Lymphozyten-Migration tritt bei der Referenzfahrt zu lymphatischen Organen, Ausfahrt aus dem Gefäßsystem, und das Eintreten in den peripheren Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden, um T-Lymphozyten-Migration zu analysieren lassen In-vitro-.

Zusammenfassung

Die Migration von T-Lymphozyten besteht der Klebstoff Wechselwirkung von Zelloberflächen Integrine mit Liganden auf anderen Zellen oder mit der extrazellulären Matrix exprimiert. Die genaue raumzeitliche Aktivierung der Integrine aus einer geringen Affinität Zustand in einen Zustand hoher Affinität an die Zelle Vorderkante ist für T-Lymphozyten-Migration wichtige

Protokoll

1. Isolierung von humanen T-Lymphozyten

1. Erhalten menschlichem Blut von einem gesunden Spender. Lassen Sie das Blut auf Raumtemperatur (~ 30 min), bevor Sie den nächsten Schritt zu kühlen.
2. Gently Pipette 3 ml Raumtemperatur Polymorph Dichtegradienten Medien in einer 8 ml-Polystyrol Röhre. Vorsichtig 3 ml Vollblut auf der Oberseite des Polymorph Medien. Es ist wichtig zur Vermeidung einer Vermischung der beiden Reagenzien.
3. Zentrifugieren bei 500 xg für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Nach der Zentrifugation wurden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) nun von anderen Blutbestandteilen in die oberste Zelle abgetrennt. Die PBMC-Schicht erscheint, von oben nach unten, als der erste Regen-Band.
5. Entfernen Sie vorsichtig die klare gelb-gefärbten oberen Phase des Blutes, über den PBMC-Schicht, und dann mit einem P1000 Mikropipette auf die PBMC-Schicht auf einer 15 ml oder 50 ml konische Röhrchen füllen.
6. Waschen Sie die PBMC zweimal mit PBS, Zentrifugation Zellen bei 500 xg für 5 Minuten jeder Zeit. Der Überstand wird etwas trübe nach jeder Wäsche.

2. Kultur von humanen T-Lymphozyten

1. Mit einer Pipette die PBMC zu einer T-75 Kulturflasche in 20 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1 pg / mL Phytohämagglutinin (PHA).
2. Bei 37 ° C und 5% CO ₂ für mindestens 1 Stunde und bis zu 24 Stunden. Dieser Schritt ermöglicht Monozyten, die sein Anhänger in den Kolben Oberfläche, von der Lymphozyten, die in der Schwebe bleiben getrennt werden. Wenn eine kurze Inkubationszeit (1 Stunde) bei diesem Schritt verwendet wird, ist es akzeptabel, RPMI 1640 Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin ohne Ergänzung mit PHA wie in Schritt 2.1 angegebene Verwendung.
3. Entfernen Sie vorsichtig alle Medien aus dem Kolben, fügen Sie ihn in einen 50 mL konischen Rohr, und Zentrifuge bei 500 xg für 5 Minuten.
4. Zellpellet, das nun in erster Linie enthält Lymphozyten, und übertragen Sie die Zellen, um eine neue T-75 Kolben mit 25 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1 pg / mL PHA.
5. Bei 37 ° C für 3 Tage (2 Tage, wenn die anfängliche Inkubation von PBMC wurde über Nacht). Nach 24 Stunden Wachstum, kann es notwendig sein, um 15-20 ml frisches Medium hinzufügen und Übertragung auf einen größeren T-175 Kolben.
6. Nach 3 Tagen Einsatz einer Pipette auf die Medien und suspendiert Lymphozyten aus dem Kolben und in ein 50 mL konischen Rohr zu entfernen. Zentrifuge bei 500 xg für 5 Minuten.
7. Zellpellet und Transfer-Zellen zu einem neuen T-75 oder T-175 Kolben mit 25 ml (T-75) oder 50 ml (T-175) RPMI 1640 mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 20 ng / mL humanem IL-2 oder IL-15.
8. Wachsen Lymphozyten für 4-7 Tage. Wenn beginnend mit einem T-75-Kolben, wird die Kultur müssen ausgebaut und in ein T-175 Kolben nach 1-2 Tagen.

3. In Vitro Lymphozytenmigration Assay

1. 1 Tag vor der Migration Assay Fell einen Glasboden 0,17 mm Schale mit 20 ug / mL Protein A oder G in PBS über Nacht bei 4 ° C.
2. Waschen Sie die Teller ausgiebig mit PBS.
3. Immobilisieren menschlichen ICAM-1/Fc (10 ug / mL) und der menschlichen SDF-1 (2 pg / mL), indem Sie diese Reagenzien in PBS-Lösung in die Schale und Inkubation 4 Stunden bei Raumtemperatur.
4. Bereiten Sie T-Lymphozyten, indem zunächst die Zelldichte in der Kultur in der T-175 Kolben mit einem Hämazytometer. Etwa 2-5 x 10 ⁵ Zellen pro Schale sollte genutzt werden, um eine Zelldichte geeignet für Migration Analyse zu erreichen.
5. Wash T-Lymphozyten zweimal mit PBS und anschließend in 1 ml L-15 Medien mit 1 mg / mL D-Glucose resuspendieren.
6. Waschen Sie die Teller mit ICAM-1/Fc und SDF-1 intensiv mit PBS beschichtet.
7. Transfer-T-Lymphozyten in 1 ml Medium in die Schale und halten sie bei 37 ° C.

4. Aufnehmen eines Bilds Sequence mit NIS Elements Software

1. Öffnen Sie NIS Elements Software.
2. In die Kamera-Einstellungen Wählen Sie im Menü "2x2 Binning", wie der Modus für Live-Imaging-und Bilderfassung.
3. Zum Menü Anwendungen und wählen Sie Definieren / Run Experiment.
4. Wählen Sie die Länge der Zeit zwischen den Bildern und die Gesamtlänge der Bilderfassung Sequenz.
5. Drücken Sie die Schaltfläche "Ausführen" die Bildaufnahme beginnen.
6. Die Zellen können verfolgt und Migration Parameter (Geschwindigkeit, Wegstrecke, Verdrängung, etc.) quantifiziert mit einem von mehreren Software-Pakete, einschließlich ImageJ, AutoQuant oder Volocity (Abbildung 1).
7. Zur Erzeugung eines "Spinnennetzes Grundstück," die XY-Koordinaten für jede Zelle und Zeitpunkt erhoben werden (Abbildung 2) und auf eine Grafik mit einem gemeinsamen Ausgangspunkt für jede Zelle im Ursprung (Abbildung 3).

5. Repräsentative Ergebnisse

Am Tag 6 der Kultur in Anwesenheit von entweder IL-2 oder IL-15, T-LymphozytenMake-up von> 98% der Zellen, wie durch positive CD3-Färbung sowie positive CD4 und / oder CD8-Färbung bestimmt. Für IL-2, fanden wir 83% CD4 +-Zellen, 15% CD8 + und <1% CD4 + CD8 +-Zellen. Für IL-15, fanden wir 88% CD4 +-Zellen, 11% CD8 + und <1% CD4 + CD8 +-Zellen. Während T-Lymphozyten-Migration auf ICAM-1/SDF-1 Substraten zeigten Zellen mit einer Geschwindigkeit von ca. 15 mu m / min, das über eine 1-stündige Frist aufrechterhalten werden kann. T-Lymphozyten-Migration auf ICAM-1/SDF-1 ist abhängig von LFA-1-vermittelte Adhäsion, als Anti-LFA-1-Ligand-blockierenden Antikörper stark hemmt die Migration.

Abbildung 1. Handy-Tracking für die Migration T-Lymphozyten. T-Lymphozyten aus Vollblut isoliert und kultiviert in Gegenwart von IL-2 oder IL-15 für 6 Tage durften halten und auf Glasboden-Schalen mit 10 ug / ml ICAM-1 und beschichtete migrieren 2 pg / mL SDF-1. Die Bilder wurden alle 10 Sekunden für 30 Minuten erworben. Die Zellen wurden in jedem Bild identifiziert und verfolgt im Laufe der Zeit mit Volocity Software. Dieser Film zeigt die zufällige Migration von T-Lymphozyten mit einer Geschwindigkeit von ca. 15 mu m / min.

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Movie 1. Zelle Verfolgung der wandernden T-Lymphozyten. T-Lymphozyten aus Vollblut isoliert und kultiviert in Gegenwart von IL-2 oder IL-15 für 6 Tage durften halten und auf Glasboden-Schalen mit 10 ug / ml ICAM-1 und 2 pg / mL SDF-1 beschichtet migrieren . Die Bilder wurden alle 10 Sekunden für 30 Minuten erworben. Die Zellen wurden in jedem Bild erkannt und verfolgt im Laufe der Zeit mit Volocity Software. Dieser Film zeigt die zufällige Migration von T-Lymphozyten mit einer Geschwindigkeit von ca. 15 mu m / min.

Abbildung 2. Spatiotemporal Zelle positionieren. Die XY-Koordinaten jeder Zelle wurden für jeden Zeitpunkt mit Volocity Software erhalten.

Abbildung 3. "Spider Web-Plot." Mit dem xyt Koordinaten für jede Zelle, 15-Zellen nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden und aufgetragen mit einem gemeinsamen Ausgangspunkt an der Herkunft. Vergleicht man Spinnennetz Parzellen gibt einen schnellen visuellen Darstellung von Unterschieden in der Migration zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen. Grundstücke für T-Lymphozyten-Migration unter Kontrollbedingungen (links) und in Anwesenheit eines anti-LFA-1-Ligand-blockierenden Antikörper (rechts).

Diskussion

In diesem Experiment, bieten wir Informationen über ein einfaches System, um die Beweglichkeit der primären menschlichen T-Lymphozyten zu analysieren. In-vitro-Assays Migration wurden verwendet, um die Rollen von vielen Molekülen und Signalwege in der Fortbewegung verschiedener Zelltypen beteiligt zu sezieren. Einige kritische Steuerungen im Auge zu behalten, wenn die Gestaltung Ihrer eigenen Experiment aus unserem Protokoll gehören: 1) Non-Klebstoff oder Nicht-Integrin-Haftgrund Beschichtungen, wie Rinderserum...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI 1640	GIBCO, von Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, von Life Technologies	15140
1-Stufen-Polymorphe	Präzise Chemikalie & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R& D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R& D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R& D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	F& Technik D Systems	350-NS