$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kalibrierung von Video-Tracking-Parametern
- Legen Sie vor Verhaltensmessungen die Beobachtungs- und Kalibrierungsparameter in der Video-Track-Software fest (siehe Materialtabelle).
- Platzieren Sie eine Vertiefungsplatte in der Aufnahmekammer mit mindestens 1 Fischlarve in einer einzelnen Vertiefung. Verwenden Sie die Platte und den zugehörigen Fisch als Darstellungen, um die Kalibrierungsparameter einzustellen.
- Klicken Sie in der Video-Track-Software auf "Datei | Protokoll generieren", wodurch ein Dialogfeld "Protokollerstellungsassistent" geöffnet wird. Geben Sie im Feld "Location Count" die Anzahl der einzelnen Wells der Well-Platte ein und klicken Sie dann auf "OK".
- Klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf "Ansicht | Vollbild", wodurch das System aufgefordert wird, eine Overhead-Kameraansicht der Bohrlochplatte anzuzeigen.
- Klicken Sie auf das Symbol "Bereiche zeichnen", das in drei mehrfarbigen Formen angezeigt wird. Wählen Sie rechts neben dem Betrachtungsbereich der Well-Platte das Kreissymbol im Feld mit der Bezeichnung "Bereiche" aus.
- Verwenden Sie den Cursor, um den kreisförmigen Video-Tracking-Bereich im oberen linken Vertiefungsbereich der Well-Platte abzugrenzen. Wählen Sie "Obere rechte Markierung" und umreißen Sie dann den Anzeigebereich oben rechts gut. Wählen Sie dann "Untere Markierung", um die untere rechte Seite gut zu umranden.
HINWEIS: Nachdem Sie den kreisförmigen Umriss gezeichnet haben, muss seine Position wahrscheinlich angepasst werden. Um die Position des Umrisses anzupassen, klicken Sie auf "Auswählen" und verschieben Sie dann mit dem Cursor den umrandeten Bereich. Konturen können auch repliziert werden, indem Sie auf "Kopieren" und dann auf "Einfügen" klicken.
- Nachdem die Bohrlochverfolgungsbereiche oben links, oben rechts und unten rechts definiert wurden, klicken Sie auf "Erstellen", um die Software aufzufordern, die Sichtbereiche der verbleibenden Bohrlöcher automatisch abzugrenzen.
- Klicken Sie im Bereich "Kalibrierung" auf "Maßstab zeichnen". Zeichnen Sie mit dem Cursor eine horizontale Linie über die Platte. Sobald die Linie gezeichnet ist, erscheint ein Dialogfeld mit der Bezeichnung "Kalibrierungsmessung". Geben Sie die Länge der Well-Platte ein und klicken Sie auf "OK".
- Beenden Sie den Zeichnungsmanager, indem Sie auf das Symbol "Bereiche zeichnen" klicken.
- Klicken Sie auf das Symbol "Kacheln". Markieren Sie mit dem Cursor alle Kästchen, die auf dem Bildschirm erscheinen, so dass jedes Kästchen grün ist.
HINWEIS: Das Kacheln-Symbol wird als eine Gruppe von sechs einzelnen kleinen Quadraten angezeigt
- "Klicken Sie auf Ansicht| Vollbild". Klicken Sie rechts neben dem Plattenbetrachtungsbereich auf "Bkg" im Feld mit der Bezeichnung "Nachweisschwelle". Verwenden Sie die Schwellenwert-Anpassungsleiste, um den Schwellenwert für die Pixelerkennung festzulegen. Sobald der entsprechende Schwellenwert für die Pixelerkennung ausgewählt ist, klicken Sie auf "Auf Gruppe anwenden".
HINWEIS: Dieses Protokoll legt die Nachweisschwelle auf 13 im schwarzen Modus für Zebrafischbeobachtungen und auf 110 im transparenten Modus für Beobachtungen von Dickkopf-Elritzen fest.
- Geben Sie in das Feld "Bewegungsschwelle" die gewünschten Parameter für die Verfolgung der Bewegungsgeschwindigkeit ein. Sobald die Geschwindigkeitsparameter eingestellt sind, klicken Sie auf "Auf Gruppe anwenden".
HINWEIS: Dieses Protokoll legt kleine/große Bewegungen auf 20 mm/s und inaktive/kleine Bewegungen auf 5 mm/s fest. Diese Auswahl programmiert die Software so, dass sie die Bewegung der Fischlarven in drei verschiedenen Geschwindigkeitsstufen verfolgt: inaktiv (Gefrieren) = <5 mm/s, klein (Cruising) = 5–20 mm/s und groß (Bursting) = >20 mm/s.
- Klicken Sie auf "Parameter | Protokollparameter" aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie im Dialogfeld die Registerkarte "Zeit". Geben Sie die Beobachtungszeit und die Integrationszeit ein. Nachdem Sie die Parameter eingegeben haben, klicken Sie auf "Ok".
- Um die Hell-/Dunkel-Photoperiode und die Lichtintensität für jede Photoperiode einzustellen, öffnen Sie das Dialogfeld für die Lichttreibereinstellungen, indem Sie im Dropdown-Menü "Parameter" die Option "Light Driving" auswählen.
HINWEIS: Siehe Protokollvideo zum Einstellen mehrerer Hell-Dunkel-Photoperioden.
- Nachdem Sie die Video-Tracking-Parameter eingestellt haben, speichern Sie das Beobachtungsprotokoll.
HINWEIS: Dieses Protokoll beobachtet das Verhalten der Fische über einen Zeitraum von 50 Minuten, der eine 10-minütige Akklimatisierungsphase umfasst, gefolgt von 4 wechselnden Hell-/Dunkelphasen, bestehend aus zwei 10-minütigen Lichtperioden und zwei 10-minütigen Dunkelperioden. Die Integrationszeit ist so eingestellt, dass das Verhalten für jede Minute des 50-minütigen Verhaltenstests gemessen wird.
2. Beobachtung des Bewegungs- und Photomotorikverhaltens von Fischlarven
- Platzieren Sie die Vertiefungsplatte mit den Versuchsfischen in der Verhaltensaufzeichnungskammer.
- Öffnen Sie in der Videotracking-Software das im nächsten Schritt entwickelte Tracking-Protokoll.
- Überprüfen Sie im Video-Tracking-Viewer, ob alle Larven auf dem Computerbildschirm sichtbar sind, dass nur eine einzelne Larve in jeder Vertiefung vorhanden ist und dass die einzelnen Vertiefungen innerhalb der Beobachtungsbereiche ausgerichtet sind, die in den Schritten 1.1.5 und 1.1.6 definiert wurden.
- Klicken Sie auf "Experimentieren | Ausführen".
HINWEIS: Das System fordert den Benutzer auf, einen Namen und einen Speicherort für die Beobachtungsdaten anzugeben.
- Nachdem Sie den Namen und den Speicherort der Beobachtungsdaten festgelegt haben, klicken Sie auf das Symbol "Mehrere Live-Bilder", um alle vordefinierten Betrachtungsbereiche hervorzuheben
HINWEIS: Dieses Symbol befindet sich am oberen Rand des Computerbildschirms und wird als Feld angezeigt, das in vier kleinere Quadrate unterteilt ist. Wenn Sie auf dieses Symbol klicken, werden alle vordefinierten Anzeigebereiche hervorgehoben.
- Schließen Sie das Bedienfeld der Aufnahmekammer und klicken Sie auf "Hintergrund | Start" auf dem Computermonitor.