Beutefang-Assay: Eine Methode zur Untersuchung des Beutefangverhaltens von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Bewertung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung in Zebrafischlarven. J. Vis. Exp.(2018)

Dieses Video beschreibt den Beutefang-Assay. Das Video diskutiert die Methode zur Untersuchung des Beutefangverhaltens von Zebrafischlarven nach der Laserablation bestimmter Neuronen.

Protokoll

1. Bewertung von Verhaltenskonsequenzen nach Laserablation

1. Richten Sie ein Verhaltensaufzeichnungssystem ein, das aus einem Stereoskop besteht, das mit einer Videokamera ausgestattet ist. Verwenden Sie eine Kamera mit einer geeigneten Bilderfassungssoftware, kommerziell oder individuell angefertigt (Abbildung 1A).
2. Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, so dass das Pantoffeltierchen durch Bildverarbeitung erkannt werden kann. Verwenden Sie beispielsweise eine ringweiße LED-Leuchte mit einem Abstandshalter (Abbildung 1B).
   Hinweis: Der Abstand und der Winkel der LED beeinflussen das Erscheinungsbild der Probe (d. h. hell auf dunklem Hintergrund oder dunkel auf hellem Hintergrund) und sind daher entscheidend für eine erfolgreiche Bildverarbeitung. Bestimmen Sie die beste Höhe des Abstandshalters (Abbildung 1C).
3. Legen Sie eine Zebrafischlarve (die aus dem in Abschnitt 1 beschriebenen Laserablationsexperiment geborgen wurde) in eine Verhaltensaufzeichnungskammer (die an einem Objektträger befestigt war), wobei die ursprüngliche obere Dichtung entfernt wurde (Abbildung 1D).
4. Sammeln Sie 50 in Wasser suspendierte Pantoffeltiere mit einer Mikropipette aus dem Becherglas und legen Sie sie in die Aufzeichnungskammer.
5. Setzen Sie ein Deckglas auf die Aufnahmekammer. Geben Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf den Deckglas, bevor Sie ihn auf die Wasseroberfläche der Aufnahmekammer legen, um das Eindringen von Luft in die Kammer zu vermeiden.
   Hinweis: In diesem Schritt läuft etwas Wasser mit Paramezie aus der Aufnahmekammer über. Die verbleibende Anzahl von Pantoffeltieren in der Aufnahmekammer beträgt etwa 30-40.
6. Platzieren Sie die Aufnahmekammer (mit einer Larve und einer Pantoffeltierchen) in das Beleuchtungssystem (Abbildung 1D).
7. Starten Sie die Zeitrafferaufnahme mit 10 fps für 11 min (6.600 Bilder).
8. (Optional) Für jede Larve, die auf ihr Verhalten getestet wurde, ist die Fluoreszenz der laserablierten Bereiche durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten, um die Wirksamkeit der Laserablation zu bestätigen (d. h. das Fehlen oder die signifikant reduzierte Anzahl von Fluoreszenzzellen im laserbestrahlten Bereich)
   Hinweis: Auch nach Bestrahlung können einige fluoreszierende Zellen aufgrund des späteren Einsetzens der Gal4-Genexpression in Zellen, die sich nach der Ablation differenziert haben, noch beobachtet werden.
9. Nachdem Sie das Verhalten der Larve aufgezeichnet haben, um den Mangel an Gleichmäßigkeit im Hintergrund auszugleichen, führen Sie eine pixelweise Division jedes Frames durch ein durchschnittliches Bild in Fidschi durch: Klicken Sie auf "Verarbeiten", "Bildrechner", "Operation: Teilen", "32-Bit(float)result" und "OK". Um ein durchschnittliches Bild zu erstellen, klicken Sie auf "Bild", "Stapel", "Z-Projekt", "Durchschnittliche Intensität" und "OK" (Abbildung 1E, F).
10. Zählen Sie die Anzahl der in der Kammer verbleibenden Pantoffeltierchen, indem Sie auf "Analysieren" und "Partikel analysieren" klicken, einen Bereichsbereich festlegen, der alle Pantoffeltierchen abdeckt, das Kontrollkästchen "Masken anzeigen" aktivieren und auf "OK" klicken. Die Option 'Show:Masks' liefert ein extrahiertes Pantoffeltierbild (Abbildung 1G) mit einer Liste der Anzahl der Partikel (Pantoffeltierchen) in jedem Frame.
11. Plotten Sie die Anzahl der in der Aufnahmekammer verbliebenen Pantoffelhäutchen im Zeitverlauf. Da die Schätzungen der Anzahl der Pantoffelhäute verrauscht sind, empfehlen wir, für jeden Punkt in einem Bereich von 600 Frames (1 Minute) in der Tabelle einen gleitenden Durchschnitt durchzuführen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Beutefang-Assay und repräsentative Daten in laserablierten Zebrafischlarven.(A) Verhaltensaufzeichnungssystem. Das Stereomikroskop war mit einer CMOS-Kamera ausgestattet. Die Bilder wurden mit einem speziell angefertigten Skript aufgenommen. (B) Bestandteile des Beleuchtungssystems. Ein graues Papier, ein Glasdiffusor, ein weißes LED-Ringlicht, ein Diffusor, ein maßgefert...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bildgebende Kammern	Grace Bio-Labore	CoverWell Bildgebungskammern PCIA-2.5	Wird als Verhaltensaufzeichnungskammer verwendet
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonik	Modell: C11440-22CU	Eine wissenschaftliche CMOS-Kamera
SZX7	Olymp		Stereoskop
Ein LED-Ringlicht	Ccs	Modell: LDR2-100SW2-LA	Weiße LED
Secure-Seal Hybridisierungskammerdichtung, 8 Kammern, 9 mm Durchmesser x 0,8 mm Tiefe	Molekulare Sonden	Katalog # S-24732	Wird als Aufnahmekammer in der Ca-Bildgebung verwendet