Escape Response Assay: Eine Methode zur Untersuchung der Reaktion von Zebrafischlarven auf Berührungsreize

Zusammenfassung

Quelle: Sztal, T. E., et al. Verwendung von berührungsevozierten Reaktions- und Fortbewegungsassays zur Beurteilung der Muskelleistung und -funktion bei Zebrafischen. J. Vis.(2016)

Dieses Video beschreibt den Tast-Evoke-Response-Assay, der die Reaktion der Zebrafischlarve auf Berührungsreize misst.

Protokoll

1. Assay für berührungsevozierte Reaktion

1. Präparation von 2 dpf-Embryonen für den Touch-evozierten Response-Assay
   1. Stellen Sie sicher, dass die Tageszeit, zu der der Test durchgeführt wird, zwischen den Experimenten übereinstimmt, da die Aktivität im Laufe des Tages stark variieren kann.
      HINWEIS: Das Experiment sollte verblindet durchgeführt werden und die Reihenfolge der Tests sollte randomisiert werden, um experimentelle Artefakte zu minimieren.
   2. Weisen Sie den Fischstämmen eine Nummer zu, die der Person, die den Versuch durchführt, unbekannt ist. Anschließend wird mit frei verfügbaren Online-Tools eine zufällige Liste erstellt, die die Reihenfolge der Tests vorgibt.
   3. Dechorionieren Sie die Embryonen mindestens eine Stunde vor dem Test, indem Sie ein Loch in das Chorion reißen und das Chorion mit einer feinen Pinzette vorsichtig auseinanderziehen. Entfernen Sie alle Rückstände aus der Petrischale, bevor Sie in den 28 °C heißen Inkubator zurückkehren.
2. Durchführung eines Assays für berührungsevozierte Reaktionen
   1. Mindestens 15 min vor Beginn der Prüfung auf 28 °C erhitzen.
      HINWEIS: Diese Stufe ist temperaturgeregelt und bleibt für die Dauer des Tests bei 28 °C. Die Temperatur beeinflusst die Aktivität und daher ist es wichtig, eine konstante Temperatur zu halten. Wenn kein beheizter Tisch zur Verfügung steht, sollte die Temperatur des Wassers überwacht werden, und alle Versuche sollten bei der gleichen Temperatur durchgeführt werden.
   2. Stellen Sie eine mit Embryomedium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ in Wasser) gefüllte Petrischale auf einen beleuchteten Tisch und montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera über der Petrischale.
   3. Starten Sie die Videokamera-Aufnahmesoftware (z. B. Stream Pix 5, hier beschrieben) und wählen Sie auf der Registerkarte "Arbeitsbereich" 1.000 Bilder pro Sekunde (1.000 fps) als Aufnahmegeschwindigkeit aus, um sicherzustellen, dass die schnelle Schwimmaktion des Fisches aufgezeichnet wird.
   4. Wenn Sie jeweils mit einem Embryo arbeiten, platzieren Sie den Embryo in der Mitte der Petrischale, wobei der Zebrafisch deutlich im Sichtfeld zu sehen ist.
      HINWEIS: Wenn der Embryo vor Beginn des Experiments wegschwimmt, ersetzen Sie ihn durch einen anderen, da das erneute Einfangen und Positionieren des Embryos dazu führen kann, dass er gegenüber dem Reiz desensibilisiert wird und wiederholte Burst-Reaktionen in einigen Krankheitsmodellen Muskelschwäche fördern können.
   5. Beginnen Sie die Aufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche "Aufnehmen" klicken, und geben Sie den mechanosensorischen Reiz an den Embryo ab, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen Nadel auf der Oberseite des Kopfes berühren.
   6. Stoppen Sie die Aufnahme, nachdem der Embryo aus dem Sichtfeld geschwommen ist oder zur Ruhe zurückgekehrt ist.
      HINWEIS: Die Beschleunigungsspitzen erreichen innerhalb der ersten 0,2 Sekunden der Burst-Escape-Reaktion nach dem mechanischen Stimulus ihren Höhepunkt. Stellen Sie daher sicher, dass sich der Fisch zumindest während der ersten 0,2 Sekunden der Aufzeichnung der Fluchtreaktion im Sichtfeld befindet. Mit der Software Stream Pix 5 werden die Daten automatisch als .avi Videodatei gespeichert. Auch alternative Video-Capture-Software wie Free Video Capture oder Softonic, die beide frei zum Download zur Verfügung stehen, könnten zum Einsatz kommen.
   7. Setzen Sie den Embryo wieder in eine neue Petrischale ein und wählen Sie einen anderen Embryo für die Untersuchung aus. Führen Sie Tests an mindestens 15 Fischen durch.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
90 mm Petrischalen	Pacific Laboratory Produkte	PT S90001
Pinzette, Stil 8	ProSciTech	Nr. T04-821
Brutkasten	Thermoline Scientific	TEI-43L
Hochgeschwindigkeits-Kamera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Schritt 1.2.3
Temperiergerät	Aussichtspunkt
http://www.randomization.com	N/A		Schritte 1.1.2