Optokinetic Response Assay: Eine Methode zur Messung der Sehschärfe bei Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Cameron, D. J., et al. Die optokinetische Reaktion als quantitatives Maß für die Sehschärfe beim Zebrafisch. J. Vis. exp.(2013)

Dieses Video beschreibt den optokinetischen Reaktionstest im Zebrafisch. Das Video misst die reflexiven Augenbewegungen anhand des visuellen Bewegungsreizes und bestimmt die Sehschärfe beim Zebrafisch.

Protokoll

1.Optokinetische Reaktion (OKR)

1. Bauen Sie das benutzerdefinierte OKR-Aufnahmegerät aus einer rotierenden Trommel mit einem Durchmesser von 14,5 cm, einem Stereomikroskop mit einstellbaren Lichtintensitätseinstellungen (300-8.000 Lux) und einem Computer (Abbildung 1A).
   1. Schließen Sie eine Kamera an das Mikroskop an, die einen Live-Feed auf einen benachbarten Monitor liefert und die Bildaufnahme und -aufzeichnung ermöglicht.
   2. Steuern Sie die rotierende Trommel mit einem Mikrocontroller, der mit einem Computer verbunden ist und verschiedene Geschwindigkeits- und Richtungsoptionen ermöglicht.
2. Betäuben Sie den Fisch für 2-3 min in 0,016% Tricain und legen Sie den Fisch dann mit den Augen und Kiemen über den Rand hängend auf eine kleine Plattform.
3. Legen Sie einen dünnen Schwamm/ein Handtuch über den Körper des Fisches und stecken Sie 2-3 Stücke Schaumstoff, die so geformt sind, dass sie den Fisch aufnehmen, über den Fisch, um ihn bewegungsunfähig zu halten. Es stellte sich heraus, dass die Begrenzung der Bewegung des Schwanzes des Fisches ein entscheidender Aspekt für die Immobilisierung ist, ohne den Fisch zu verletzen, und am besten mit einem flachen Stück Schaumstoff erreicht wird. (Abbildung 1B)
4. Positionieren Sie den Fisch in einem zylindrischen, mit Wasser gefüllten Tank, der in die rotierende Trommel des OKR-Aufnahmegeräts passt. Verwenden Sie Magnete auf der Plattform, um den Fisch aufrecht zu positionieren, wobei die Augen ca. 7,3 cm vom Rand der Trommel entfernt sind. Der Fisch sollte innerhalb weniger Minuten aus der Narkose wieder auferstehen - die normale Atmung wird wieder aufgenommen und es sollten zufällige Augenbewegungen beobachtet werden.
5. Legen Sie ein Basisgitter von 0,07 Zyklen pro Grad (cpd) in die rotierende Trommel und aktivieren Sie die Computersteuerung, um die Drehung und Videoaufnahme zu starten (für dieses Papier wurde eine Drehzahl von 12 U/min verwendet, aber Geschwindigkeiten von 8-16 U/min sollten ähnliche Ergebnisse liefern).
6. Sobald ein anfängliches OKR durch das Basisgitter ausgelöst wird, pausieren Sie die Drehung kurz und ersetzen Sie das Gitter durch ein kleineres Gitter (höhere Ortsfrequenz).
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis kein OKR mehr hervorgerufen werden kann. Wiederholen Sie den Test mit dem kleinsten Gitter, das ein OKR nach einem modifizierten Treppenansatz verursacht hat, und wiederholen Sie dann die Verwendung des Gitters, das keine Antwort hervorgerufen hat, um den Verlust des OKR zu überprüfen. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um eine echte Reaktion auf das kleinste nachweisbare Gitter zu überprüfen, wenn sich das endgültige Gitter relativ zum ersten Extinktionsereignis geändert hat.
8. Um die monokulare Sehschärfe zu messen, legen Sie einen schwarzen Kunststoffokkluder über die Streifen neben dem gegenüberliegenden Auge. Wiederholen Sie die oben beschriebene Vorgehensweise (Schritte 1.6-1.7).
9. Ermitteln Sie die Sehschärfe des gegenüberliegenden Auges, indem Sie den Okkluder neu positionieren und die Schritte 1.6-1.7 erneut wiederholen.
10. Notieren Sie sich während des Testvorgangs den Abstand, in dem sich jedes Auge von den Streifen befindet, indem Sie den Referenzmessstreifen unter dem Aquarium verwenden, damit in den folgenden Schritten genaue Sehschärfemessungen berechnet werden können.

2. Berechnung der Sehschärfe

1. Ermitteln Sie die Sehschärfe, indem Sie die cpd berechnen: wobei a der Abstand von der Mitte der Linse zum Gitter und h die Länge eines Zyklus des kleinsten Gitters ist, bei dem OKR beobachtet wurde (Abbildung 1C).
2. Für die kombinierte Sehschärfemessung wird der gemittelte a-Wert sowohl des linken als auch des rechten Auges verwendet.

Ergebnisse

Abbildung 1. OKR-Aufnahme. A) Das OKR-Gerät besteht aus einer rotierenden Trommel mit einem Durchmesser von 14,5 cm und einem Mikroskop mit einstellbarer Lichtintensität (300-8.000 Lux). Eine Kamera liefert einen Live-Feed auf einem angrenzenden Monitor. Die rotierende Trommel verfügt über verschiedene Geschwindigkeitseinstellungen sowohl im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn, und austausc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Super Low Light Schwarz-Weiß-Videoüberwachungskamera	Super-Schaltkreise	PC164CEX-2	Jede Low-Light-Kamera kann verwendet werden
Arduino Duemilanove Mikrocontroller	Adafruit Branchen		Der Arduino Uno ist auch mit der Geschwindigkeitssteuerungssoftware kompatibel.
Tricain-Methansulfonat	VWR	Tel.: 101107-950