Zebrafischvermeidung und Thigmotaxis-Assay: Eine Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung des Larvenverhaltens als Reaktion auf aversiven visuellen Reiz

Abstract

Quelle: Richendrfer, H., et al. Automatisierte Hochdurchsatz-Verhaltensanalysen bei Zebrafischlarven. J. Vis. Exp.(2013)

Das Video beschreibt die Vermeidung und den Thigmotaxis-Assay von Zebrafischlarven. Das Video untersucht das Verhalten von Zebrafischlarven als Reaktion auf visuelle aversive Reize.

Protocol

1. Bilderfassung

1. Bis zu 20 Larven können in jede Bahn der Platten gesetzt werden. In der Regel werden 5 Larven pro Bahn verwendet, um die genaueste Verfolgung der Schwimmgeschwindigkeit zu ermöglichen und die Anzahl der Larven zu reduzieren, die pro Experiment benötigt werden. Die Bahnen können je nach Experiment mit Eiwasser gefüllt werden, mit oder ohne Pharmazeutika oder Giftstoffe. Die Bahnen sollten jedoch nicht vollständig gefüllt werden, bis sie in den Bildschränken platziert sind. Dadurch wird ein Überlaufen vermieden. Aus Gründen der Konsistenz sollten die Larven eine Eingewöhnungszeit von zehn Minuten haben, nachdem sie in die Agaroseformen gelegt und auf dem Laptop-Bildschirm positioniert wurden. Der effiziente Transport der Larven von der Petrischale in die Agarosebahn trägt dazu bei, den Stress der Larven zu reduzieren. Dies ist am einfachsten, wenn die Larven in flachen Becken oder Petrischalen untergebracht sind.
2. In den Bildschränken befinden sich eine Canon Digitalkamera, die für Zeitrafferaufnahmen verwendet wird, und ein Laptop. Die Kamera sollte an der Oberseite des Schranks platziert und auf die Unterseite des Schranks gerichtet werden, wo ein Laptop mit 15,6-Zoll-Bildschirm mit dem Bildschirm nach oben aufgestellt werden sollte (Abbildung 1). Vier Platten sollten von Hand direkt auf dem Laptop-Bildschirm positioniert werden. Zu diesem Zeitpunkt können die Bahnen mit Eiwasser oder chemischer Behandlung abgefüllt werden, so dass sie auf gleicher Höhe mit dem oberen Rand der Bahnen sind (um Schatten an den Rändern der Bahnen in den Bildern zu vermeiden).
3. Eine PowerPoint-Präsentation wird als aversiver Reiz für die Larven eingesetzt. In der Vergangenheit wurden sich bewegende rote Bälle an Zebrafischlarven in 6 oder 12 Multi-Well-Platten gezeigt. Die aktuelle PowerPoint-Präsentation beginnt 15 Minuten lang mit einem leeren weißen Hintergrund, gefolgt von 15 Minuten mit einem sich bewegenden roten Balken in der oberen Hälfte der Platte (Abbildung 2). Um eine Überhitzung der Larven zu vermeiden, ist es am besten, einen Laptop mit einer Bildschirmtemperatur zu kaufen, die nicht über 28 °C steigt. Um eine Verdunstung der Flüssigkeit innerhalb der Agarosebahnen zu vermeiden, sollte die maximale Bildgebungszeit auf unter einer Stunde begrenzt werden.
4. Die Digitalkamera sollte für Zeitrafferfotografie programmiert sein und alle 6 Sekunden Bilder aufnehmen, also insgesamt 300 Bilder pro Experiment. Die Häufigkeit und Länge kann jedoch je nach Experiment und Verhaltensquantifizierung angepasst werden. In der Vergangenheit wurden längere Bildgebungszeiten mit längeren Abständen zwischen den einzelnen Bildern verwendet. Die Kamera kann auf eine niedrigere Auflösung eingestellt werden, um Bilder mit Videogeschwindigkeit (30 Bilder pro Sekunde) zu erzeugen. Während die niedrigere Auflösung die Aufnahmen auf eine einzige Multiwell-Platte beschränkt, eignen sich die Videoaufzeichnungen für die Abbildung von Schnellschwimmveranstaltungen.

Results

Abbildung 1. Bildgebende Werkbänke. Die Bildgebenden Werkbänke wurden speziell in unserem Labor gebaut und für Hochdurchsatz-Verhaltensanalysen eingesetzt. Eine 15-Megapixel-Digitalkamera wurde an der Oberseite des Gehäuses mit dem Gesicht nach unten befestigt, um Zeitrafferbilder der Larven auf mehrspurigen Platten zu sammeln, die auf dem Bildschirm eines Laptops platziert wurden. Zwischen den Platten und dem Bildsch...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bildgebende Schränke	WoodCraft Türme
Agarose	Fischer	Nr. BP1356-100
Digitalkamera	Canon EOS	Rebell T1i
Laptops	Acer Aspire		Jeder ist gut, solange er einen 15,6 Zoll hat. LCD-Bildschirm mit einer Auflösung von 1366 x 768 Pixeln und einer Helligkeit von 220 cd/m2.
One-Well-Platten	Fischer	Tel.: 12-565-493
PowerPoint 2010	Microsoft
Diffusor aus Kunststoff	Pendaflex	Artikel-Nr.: 52345