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>1. Übertragung der Bibliothek für kleine Moleküle
Während der Transfer von Verbindungen mit robotergestützten Transfermethoden automatisiert werden kann, werden wir die manuelle Transfermethode beschreiben.
- Kleine Molekülbibliotheken werden in der Regel in einem 96-Well-Format geliefert, wobei jede Verbindung in DMSO als 10-mM-Stamm gespeichert wird. Etwa 60 Minuten, bevor die Embryonen das Stadium erreichen, in dem die Verbindungen hinzugefügt werden sollen, tauen Sie eine gewünschte Anzahl von 96-Well-Platten auf, die Aliquots kleiner Moleküle enthalten (Quellplatte). Notieren Sie sich die Serien- oder andere Identifikationsnummer der Typenschilder. Um die Kondensation auf den Platten zu minimieren, kann das Auftauen in einer Trockenkammer erfolgen, die Drierit (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) enthält.
- Schleudern Sie die Platten kurz in einer Tischzentrifuge, die mit einem Multiwell-Plattenadapter ausgestattet ist.
- Entfernen Sie das Aluminium-Dichtungsband von der Quellplatte. Verdünnen Sie die Verbindungen in der Ausgangsplatte mit einer 12-Kanal-Pipette auf eine Konzentration von 0,5 mM (wenn Sie z. B. mit 250 nL-Aliquoten von 10 mM beginnen, fügen Sie 4,75 μl DMSO in jede Vertiefung hinzu).
- Wenn die Embryonen in der 96-Well-Platte (Empfängerplatte) das gewünschte Stadium erreichen, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette (2-20 μl), um 2,5 μl Verbindungen (0,5 mM) von den Quellplatten in die Empfängerplatten mit den Embryonen zu übertragen.
- Notieren Sie die Identifikationsnummer der Quellplatten auf den Embryoplatten des Empfängers. Decken Sie die Empfängerplatten, die nun die Embryonen und Verbindungen enthalten, mit Deckeln ab, mischen Sie die Platten vorsichtig durch leichtes Schwenken und legen Sie sie in einen 28,5 °C heißen Inkubator.
- Decken Sie jede Quellplatte, die unbenutzte kleine Moleküle (0,5 mM) enthält, mit einem Aluminium-Dichtungsband ab und stellen Sie sie zur Langzeitlagerung in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
>2. Screening auf Auswirkungen kleiner Moleküle durch visuelle Inspektion von Phänotypen
- Formulieren Sie vor der Durchführung des Screenings ein spezifisches Kriterium dafür, was einen "Treffer" darstellen würde.
- Nehmen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten in der Entwicklung die 96-Well-Platten mit compoundbehandelten Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen Sie jede Well unter einem Stereomikroskop. Zur besseren Visualisierung subtiler Veränderungen, wie z. B. Veränderungen des Kreislaufmusters, kann ein Phasenkontrast-Inversmikroskop verwendet werden. Die Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Störung der Expression von GFP- oder DsRed-Proteinen unter einem gewebespezifischen Promotor zu untersuchen.
- Scannen Sie die 96-Well-Platten schnell nach Vertiefungen, in denen mindestens 3 von 5 Embryonen den vorgeschriebenen "Hit"-Phänotyp aufweisen. Notieren Sie die Identität der Platte und die Position der Vertiefung jedes potenziellen Treffers.
- Bestätigen Sie einen potenziellen Treffer, indem Sie die Wirkung der Verbindung in mehreren Dosen (1 μM, 5 μM, 10 μM und 50 μM) erneut testen. Für jede Dosis werden 10 Embryonen in 0,5 ml E3-Medium in einem 48-Well-Plattenformat getestet. Der Zeitpunkt der Zugabe von Verbindungen für die Wiederholungsprüfung sollte mit dem des ursprünglichen Screenings identisch sein. Ein Treffer wird bestätigt, wenn der hervorgerufene Phänotyp bei einem erneuten Test der Verbindung reproduziert wird
- Identifizieren Sie die Trefferverbindung aus der Datenbank der kleinen Moleküle in der chemischen Bibliothek.