Overview
המאמר מתאר אבלציה ממוקדת בכבד, שיטה לגרימת מוות hepatocyte עם metronidazole בזחלים זברה מהונדסים. פרוטוקול המדגם מתאר את תהליך הייצור, המניפולציה וההערכה של אבלציה ממוקדת בכבד בזברה- דג.
Protocol
1. הכנת עוברים/זחלים
- מעבירים 100 עוברים לתבשיל פטרי 100 מ"מ עם 25 מ"ל של מי ביצה. שמור לא יותר מ 100 עוברים לכל צלחת פטרי ולהרים אותם ב 28 מעלות צלזיוס.
- כדי לעכב פיגמנטציה, להוסיף phenylthiourea (PTU) לתוך צלחות פטרי לפני 10 שעות לאחר ההפריה (hpf), ולהרים עוברים / זחלים עד 80 hpf. הריכוז הסופי של PTU הוא 0.2 מ"מ.
התראה:PTU הוא רעיל. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות. - הרדמה את הזחלים על ידי הוספת 3-אמינו חומצה בנזואית אתיל אסתר (Tricaine), בריכוז סופי של 0.016%, לתוך צלחות פטרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, מיין זחלים CFP חיובי. השתמש זחלים עם גודל כבד דומה להשליך אלה עם כבד קטן יותר או גדול יותר.
הערה: כל זחלים CFP חיובי, ללא קשר לעוצמה, ניתן להשתמש כי אין הבדל בהיקף אבלציה hepatocyte בין הזחלים hemizygous ו homozygous.
התראה:טריקאין הוא רעיל. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות. - הסר את מי הביצה המכילים Tricaine ולהוסיף מים ביצה בתוספת 0.2 mM PTU. שמור על העוברים / הזחלים ב 28 מעלות צלזיוס.
2. טיפול Mtz
- הכינו תמיסת Mtz טרייה של 10 מ"מ על ידי המסת 0.171 גרם אבקת Mtz במי ביצה של 100 מ"ל בתוספת 0.2% DMSO ו-0.2 מ"מ PTU. כדי להמיס לחלוטין את Mtz, לערבב את הפתרון ב RT עם ערבוב מהיר במשך 20-30 דקות. כדי לעזור לסלוביליזציה של מץ ולשפר את חדירת מץ לזחלים, הוסיפו DMSO בעת הכנת מץ.
התראה: חשיפה ממושכת או ריכוז מוגבר של Mtz הוא רעיל. יש להשתמש בהתאם להנחיות הטיפול המתאימות. - הפרד את הזחלים לקבוצות בקרה וניסיון על ידי העברת המספר הרצוי של זחלים לשתי צלחת פטרי 100 מ"מ שונים או צלחת רב-באר. עבור קבוצת הניסוי, לשמור על הזחלים ב 10 mM Mtz פתרון; עבור קבוצת הביקורת, לשמור אותם במי ביצה המכילים 0.2% DMSO.
- מכסים את הצלחות או צלחות הפטרי המכילות את הפתרון Mtz עם רדיד אלומיניום כדי למנוע את הצילום-השבתה של Mtz, ואת הדגירה ב 28 °C (69 °F). משך הטיפול ב- Mtz תלוי בשלב הזחל ובקו הטרנסגני.
3. ניתוח של התחדשות כבד מונעת מרה
- בסוף תקופת אבלציה, להסיר את הפתרון Mtz מן הצלחות. לשטוף את הזחלים שטופלו Mtz על ידי הוספת 25 מ"ל של מים ביצה. מערבבים את הצלחת 2-3 פעמים כדי לשטוף את הזחלים לפני השלכת מי הביצה. חוזרים על הפעולה שלוש פעמים ואז טובלים את הזחלים פעם נוספת במי ביצה. כדי למנוע בצקת לב ומוות זחל בזחלים שטופלו Mtz, להוסיף ריכוז נמוך יותר של Tricaine, בריכוז הסופי של 0.008%, כדי לשתק את הזחלים.
- לניתוח כבד, לבחון את גודל הכבד של הזחלים שטופלו Mtz תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP. להעריך את רמות אבלציה hepatocyte מבוסס על גודל הכבד היחסי: גדול (ללא אבלציה; 0-10% זחלים), בינוני (ablated חלקית; 10-20%), וקטן מאוד (ablated מלא; 80-90%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. | ||
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA |
