Morpholino-Injektion: Eine Methode zur Unterdrückung der Zielgenexpression zur Untersuchung der Funktion im Zebrafisch

Abstract

Quelle: Hyde D.R., et al. In vivo Elektroporation von Morpholinos in die regenerierende Schwanzflosse des adulten Zebrafisches. J. Vis. Exp. (2012)

Das Protokoll beschreibt den gezielten Knockdown der Genexpression im Zebrafisch durch Morpholino-Injektion in den Schwanz.

Protocol

>1. Morpholino-Injektion

1. Am Tag vor der Injektion des Morpholino wird eine Injektionsplatte angefertigt (Abbildung 1). Achten Sie darauf, an einem Ende der Vertiefung eine Kerbe auszuschneiden, die hilft, den Fisch für die Mikroinjektion zu stabilisieren.
2. Verdünnen Sie das mit Fluorescein markierte Morpholino auf die richtige Konzentration (empfohlen, mit 1,2 mM zu beginnen) und legen Sie es 5 Minuten lang in ein 65 °C heißes Wasserbad.
3. Laden Sie die Nadel mit dem Morpholino (Hinweis: Je nachdem, ob Sie hinterfüllen oder frontladen, bestimmt Ihre Nadel, ob Sie zuerst die Nadel laden oder die Spitze zuerst abschneiden).
4. Schneide die Spitze schräg von der Nadel ab.
5. Befolgen Sie die Anweisungen Ihres Mikroinjektionssystems, um eine Blase Morpholino von ca. 5 nl pro Injektion zu injizieren. Größere Volumina von Morpholino könnten das Gewebe stören.
6. Betäuben Sie den Fisch und legen Sie ihn auf eine Injektionsplatte. Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit und richten Sie die Nadel an der entsprechenden Stelle aus, nur distal zum Knochenstrahl (Abbildung 2). Unter Verwendung eines Mikroskops und einer Mikroinjektionsvorrichtung, die für Morpholino-Injektionen geeignet sind (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), injizieren Sie das Morpholino von vorne nach hinten in die Flosse, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Injektion von posterior nach anterior führt dazu, dass sich das Flossengewebe während der Injektion aufrollt und sehr schwierig ist.
7. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe ein, nur distal zu jedem Knochenstrahl (in Abbildung 2 mit "1" gekennzeichnet) und drücken Sie sie distal, bis sie sich im Blastem befindet (in Abbildung 2 mit "2" gekennzeichnet). Achte darauf, dass du die Nadel nicht durch die gesamte Flosse schiebst. Wenn die Nadel richtig lokalisiert ist, injizieren Sie das Morpholino (d. h. klicken Sie einmal). Bei 1,2 mM erscheint die mit Fluorescein markierte Morpholinolösung auch unter normalen Lichtbedingungen gelbgrün. Bei jeder Injektion kann ein gelber "Puff" der Morpholino-Lösung sichtbar gemacht werden, der hilft, die Injektion in das Blastem zu lokalisieren. Pro Knochenstrahl sollten ca. 75 nl (10-15 Klicks) Morpholino-Lösung injiziert werden. Pause ~ 1 Sekunde zwischen den Klicks. Wir injizieren nur die dorsale Seite und verwenden die ventrale Seite als reine Elektroporationskontrolle.

Results

Abbildung 1. A. Schematische Darstellung der Injektionsplatte, die aus Agarose besteht und eine kleine Vertiefung enthält, um den Fisch während der Mikroinjektion des Morpholino zu halten.

Abbildung 2. Schema der Morpholino-Mikroinjektion. A. Legen Sie den Fisch in die S...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morpholino	GeneTools, LLC		Morpholino sollte speziell auf das Protein Ihres Interesses zugeschnitten werden
Mikro-Injektionspumpe	World Precision Instruments, Inc.	PV830	Pneumatische PicoPump Viele verschiedene Mikroinjektionssysteme können verwendet werden
Mikro-Manipulator	World Precision Instruments, Inc.	MMJR	Rechtshänder (MMJL für Linkshänder)
Mikroinjektionsnadeln, 1,0 mm Außendurchmesser	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4	Dabei handelt es sich um Kapillaren aus Borosilikatglas, die in eine Nadel gezogen
Nadelhalter	World Precision Instruments, Inc.	5430-ALLE	Pico Nozzle Kit; achten Sie darauf, dass die 1,0 mm Pipettendichtung eingesetzt ist
Nadelabzieher	Sutter Instrument Co.	P-97	Andere Mikropipetten-/Nadelabzieher sollten auch funktionieren
Mikroskop	Leica, Nikon, Zeiss	Anzahl variiert je nach Hersteller	Jedes Stereomikroskop mit 20-facher Optik und der Möglichkeit, mit Mikromanipulatoren zu arbeiten
2-Phenoxyethanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anästhesie; 1:1000 in Wasser des Fischsystems für den Eingriff verdünnen, 1:500 für die Euthanasie