Morpholino-Injektion: Eine Methode zur Unterdrückung der Zielgenexpression zur Untersuchung der Funktion im Zebrafisch

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Hyde D.R., et al. In vivo Elektroporation von Morpholinos in die regenerierende Schwanzflosse des adulten Zebrafisches. J. Vis. Exp. (2012)

Das Protokoll beschreibt den gezielten Knockdown der Genexpression im Zebrafisch durch Morpholino-Injektion in den Schwanz.

Protokoll

>1. Morpholino-Injektion

Am Tag vor der Injektion des Morpholino wird eine Injektionsplatte angefertigt (Abbildung 1). Achten Sie darauf, an einem Ende der Vertiefung eine Kerbe auszuschneiden, die hilft, den Fisch für die Mikroinjektion zu stabilisieren.
Verdünnen Sie das mit Fluorescein markierte Morpholino auf die richtige Konzentration (empfohlen, mit 1,2 mM zu beginnen) und legen Sie es 5 Minuten lang in ein 65 °C heißes Wasserbad.
Laden Sie die Nadel mit dem Morpholino (Hinweis: Je nachdem, ob Sie hinterfüllen oder frontladen, bestimmt Ihre Nadel, ob Sie zuerst die Nadel laden oder die Spitze zuerst abschneiden).
Schneide die Spitze schräg von der Nadel ab.
Befolgen Sie die Anweisungen Ihres Mikroinjektionssystems, um eine Blase Morpholino von ca. 5 nl pro Injektion zu injizieren. Größere Volumina von Morpholino könnten das Gewebe stören.
Betäuben Sie den Fisch und legen Sie ihn auf eine Injektionsplatte. Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit und richten Sie die Nadel an der entsprechenden Stelle aus, nur distal zum Knochenstrahl (Abbildung 2). Unter Verwendung eines Mikroskops und einer Mikroinjektionsvorrichtung, die für Morpholino-Injektionen geeignet sind (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), injizieren Sie das Morpholino von vorne nach hinten in die Flosse, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Injektion von posterior nach anterior führt dazu, dass sich das Flossengewebe während der Injektion aufrollt und sehr schwierig ist.
Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe ein, nur distal zu jedem Knochenstrahl (in Abbildung 2 mit "1" gekennzeichnet) und drücken Sie sie distal, bis sie sich im Blastem befindet (in Abbildung 2 mit "2" gekennzeichnet). Achte darauf, dass du die Nadel nicht durch die gesamte Flosse schiebst. Wenn die Nadel richtig lokalisiert ist, injizieren Sie das Morpholino (d. h. klicken Sie einmal). Bei 1,2 mM erscheint die mit Fluorescein markierte Morpholinolösung auch unter normalen Lichtbedingungen gelbgrün. Bei jeder Injektion kann ein gelber "Puff" der Morpholino-Lösung sichtbar gemacht werden, der hilft, die Injektion in das Blastem zu lokalisieren. Pro Knochenstrahl sollten ca. 75 nl (10-15 Klicks) Morpholino-Lösung injiziert werden. Pause ~ 1 Sekunde zwischen den Klicks. Wir injizieren nur die dorsale Seite und verwenden die ventrale Seite als reine Elektroporationskontrolle.

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Ergebnisse

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Abbildung 1. A. Schematische Darstellung der Injektionsplatte, die aus Agarose besteht und eine kleine Vertiefung enthält, um den Fisch während der Mikroinjektion des Morpholino zu halten.

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Abbildung 2. Schema der Morpholino-Mikroinjektion. A. Legen Sie den Fisch in die S...