Paarung und Eizellimplantation: Eine Methode, um Embryonen zu erzeugen und sie nach Entwicklungsstadien zu sortieren

Abstract

Quelle: Hostelley T.L., et al. Probenvorbereitung und Analyse von RNASeq-basierten Genexpressionsdaten aus Zebrafischen. J. Vis. Exp. (2017)

Der Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zebrafischembryonen durch natürliche Paarung und Sortierung ihrer Entwicklungsstadien. Das Protokoll wird weiterhin für die Analyse von Pankreas-β-Zellen unter Verwendung transgener Fische verwendet.

Protocol

>1. Erzeugung von Embryonen durch natürliche Paarung

1. Kultivierung von Embryonen bis zu einem Alter von 3 Monaten, reproduktive Reife.
2. Trennen Sie erwachsene männliche und weibliche Fische vom gewünschten Stamm am Abend vor der Embryoentnahme in geteilte Paarungsbecken und fügen Sie jedem Becken 2 Männchen und 3 Weibchen hinzu.
   HINWEIS: Die Verwendung des transgenen fluoreszierenden Reporterstamms insulin2a:mCherry ermöglichte die Analyse von Pankreas-β-Zellen.
3. Setzen Sie die Fische mit frischem Systemwasser in das Begattungsbecken um und entfernen Sie die Trennwand sofort, nachdem die Lichter am nächsten Morgen angeschaltet sind.
4. Lassen Sie die Fische sich auf natürliche Weise paaren, bis Embryonen im Bodenbecken beobachtet werden. Entnehmen Sie die Embryonen in 30-minütigen Intervallen, bis die gewünschte Menge entnommen ist. Lagern Sie jeden gesammelten Zeitpunkt in separaten Petrischalen im Embryomedium bei 28,5 °C.
5. Führen Sie die Mikroinjektion von genetischem Material durch oder platzieren Sie es in experimentellen Nährmedien, falls gewünscht, und kultivieren Sie die Embryonen in frischem Hank-Embryomedium in 10-cm-Petrischalen bei 28,5 °C.
   HINWEIS: Bei der Genexpressionsanalyse bei Morpholino (MO)-injizierten oder mutierten Tieren ist zu beachten, dass jede Manipulation zufällige Auswirkungen auf die Genexpression haben kann. Mutanten können eine genetische Kompensation auf einer Transkriptionsebene aufweisen, die durch MO-basiertes Gen-Targeting nicht beobachtet wird.

>2. Embryonen im Stadium

1. Kultivieren Sie die Embryonen in Gruppen von 50-75 Embryonen pro 10-cm-Petrischale, um ein konsistentes Entwicklungstiming aller Embryonen zu fördern.
2. Überwachen Sie die Entwicklungsmorphologie mit dem Präpariermikroskop im Blastomer-, Epibolie- und Somitenstadium, um den Entwicklungsfortschritt sicherzustellen.
   HINWEIS: Entfernen Sie absterbende oder missgebildete Embryonen, um eine Entwicklungsverzögerung in der Schale zu vermeiden.
3. Trennen Sie die Embryonen nach dem Entwicklungsalter. Stadien der Embryonen und Larven anhand der Gesamtkörperlänge nach 24 hpf.
   HINWEIS: Bei den Somiten handelt es sich um das chevronsförmige mesodermale Gewebe, das sich auf dem dorsalen Teil des Embryos befindet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mKirsche	ZIRC	ZL1483
Passende Tanks 1.0L Kreuzungstank Set	Aquaneering	ZHCT100
Präpariermikroskop	Zeiss