DNA-Extraktion aus dem Schwanzclip: eine Methode zur Genotypisierung von Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Xing L., et al. Schnelle und effiziente Zebrafisch-Genotypisierung mittels PCR mit hochauflösender Schmelzeanalyse. J. Vis. Exp. (2014).

Dieser Artikel beschreibt die DNA-Extraktion aus dem Zebrafisch-Schwanzclip. Das Protokoll demonstriert eine schnelle und effiziente Methode zur Analyse von Zebrafisch-Genotypen.

Protokoll

1. DNA-Vorbereitung

1. Bereiten Sie den DNA-Lysepuffer vor: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3 % Tween 20, 0,3 % NP40. Geben Sie am Tag der Anwendung frische Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml.
2. Gewebeentnahme:
   1. Für ausgewachsene Fischflossenclips:
      1. Fisch anästhesieren: Legen Sie den Fisch in eine 0,004%ige MS-222 (Tricain)-Lösung. Warten Sie, bis sich die Kiemenbewegung verlangsamt.
      2. Legen Sie den Fisch auf einen Stapel von 5-10 Kimwipes und schneiden Sie mit einer sterilen Rasierklinge ein kleines Stück der Schwanzflosse, ca. 2-3 mm, ab.
      3. Setze den Fisch schnell in ein beschriftetes Aquarium mit frischem Wasser, damit er sich erholen kann. Beschrifte sowohl das Aquarium als auch das entsprechende Rohr, in dem sich der Flossenclip befindet. Wechseln Sie das Wasser und füttern Sie die Fische jeden zweiten Tag.
      4. Nehmen Sie den Flossenclip mit einer sterilen Pipettenspitze auf und geben Sie ihn in ein Röhrchen, das mit 100 μl DNA-Lysepuffer gefüllt ist.
      5. Entsorge die Pipettenspitze und die Rasierklinge in einen Behälter für scharfe Gegenstände.
   2. Für den Schwanzclip des Embryos:
      1. Legen Sie die Embryonen in eine 0,004%ige MS-222 (Tricain) -Lösung. Warten Sie 2 Minuten.
      2. Schneide ein Stück Schwanz mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop ab.
      3. Legen Sie den Schwanz in ein beschriftetes Röhrchen, das mit 30 μl DNA-Lysepuffer gefüllt ist.
      4. Legen Sie den Embryo schnell in ein Röhrchen mit 100 μl 4% Paraformaldehyd.
      5. Etikettieren Sie Eileiter mit Embryonen und den entsprechenden Schwanzröhren.
      6. Lagern Sie die Eileiter mit den Embryonen über Nacht bei 4 °C zur Fixierung.
      7. Reinigen Sie die Pinzette mit Milli-Q Wasser und Kimwipes zwischen den einzelnen Embryonen, um die Kontamination zu minimieren.
   3. Für ganze Embryonen:
      1. Legen Sie die Embryonen in eine 0,004%ige MS-222 (Tricain) -Lösung. Warten Sie 2 Minuten.
      2. Geben Sie 1-5 Embryonen in ein Röhrchen, das mit 100 μl DNA-Lysepuffer gefüllt ist. Eine Dechorionierung ist nicht erforderlich.
3. DNA-Verdau
   Inkubieren Sie die Eileiter mit Gewebe (Flossen- oder Schwanzclips oder Embryonen) bei 55 °C für 4 Stunden bis über Nacht.
4. Inaktivierung der Proteinase K
   Die Röhren 15 Minuten lang auf 95 °C erhitzen. Die DNA sollte sofort für die PCR verwendet oder bis zu 3 Monate lang bei -20 °C gelagert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 Reaktions-LightScanner Master-Mix	BioFire	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Tricain
Paraformaldehyd