Probenvorbereitung für die Lichtblattmikroskopie: Einbetten lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung

Abstract

Quelle: Icha J., et al. Verwenden der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zur Abbildung der Entwicklung von Zebrafischaugen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieser Artikel beschreibt die Probenvorbereitung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Es demonstriert auch eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung, die die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht.

Protocol

>1. Probenvorbereitung

1. Zubereitung der Agarose-Mischung
   1. 15 min vor der Herstellung der Agarosemischung ein 1 ml aliquotes Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (gelöst in E3-Medium) in einem auf 70 °C eingestellten Heizblock schmelzen. Sobald die Agarose vollständig geschmolzen ist, werden 600 μl in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen überführt, 250 μl E3-Medium, 50 μl 0,4 % MS-222 und 25 μl Wirbelkügelchenlösung hinzugefügt.
      Anmerkung: Das macht 925 μl des Mixes, während für die Flüssigkeit, die später zusammen mit den Embryonen zugegeben wird, weitere 75 μl berechnet werden.
   2. Bewahren Sie das Röhrchen in einem zweiten Heizblock bei 38-40 °C auf oder stellen Sie sicher, dass die Agarose sehr nahe an ihrem Gelierpunkt ist, bevor Sie Probenembryonen hineinlegen.
2. Einbetten der Embryonen
   1. Nehmen Sie fünf Glaskapillaren mit einem Volumen von 20 μl (mit schwarzer Markierung, ~1 mm Innendurchmesser) und setzen Sie die passenden Kolben mit Teflonspitze hinein. Schiebe den Kolben durch die Kapillare, so dass sich die Teflonspitze am unteren Rand der Kapillare befindet.
   2. Übertragen Sie fünf Embryonen (eine Anzahl, die auf einmal montiert werden kann) mit einer Glas- oder Plastikpipette in das Röhrchen mit einer wirbelnden 37 °C warmen Agarosemischung.
      Anmerkung: Versuchen Sie, ein Minimum an Flüssigkeit zusammen mit den Embryonen zu transportieren.
   3. Führen Sie die Kapillare in die Mischung ein und saugen Sie einen Embryo hinein, indem Sie den Kolben nach oben ziehen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Embryos vor dem Schwanz in die Kapillare eintritt. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen dem Kolben und der Probe. Über dem Embryo sollte sich ±2 cm Agarose und ±1 cm unterhalb des Embryos befinden. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Embryonen.
   4. Warten Sie, bis die Agarose vollständig erstarrt ist, was innerhalb weniger Minuten geschieht, und lagern Sie die Proben dann in E3-Medium, indem Sie sie mit Plastilin oder Klebeband an die Wand eines Becherglases kleben. Die untere Öffnung der Kapillare sollte frei in der Lösung hängen, um einen Gasaustausch zur Probe zu ermöglichen.
      HINWEIS: Ein ähnliches Protokoll wie in den Abschnitten 1.1 und 1.2 finden Sie auch auf der OpenSPIM-Wiki-Seite http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

>2. Positionierung der Probe

1. Montage des Probenhalters
   1. Setzen Sie 2 Kunststoffhüllen der richtigen Größe (schwarz) gegeneinander in den Stiel des Probenhalters ein. Ihre Schlitzseiten müssen nach außen zeigen. Befestigen Sie die Klemmschraube locker, indem Sie sie 2-3 Runden drehen. Führen Sie die Kapillare durch die Klemmschraube und schieben Sie sie durch die Halterung, bis auf der anderen Seite das schwarze Farbband sichtbar wird. Vermeiden Sie es, den Kolben zu berühren.
   2. Ziehen Sie die Klemmschraube fest. Schieben Sie die überschüssigen 1 cm Agarose unterhalb des Embryos aus der Kapillare und schneiden Sie sie ab. Setzen Sie den Stiel in die Probenhalterscheibe ein.
   3. Bestätigen Sie in der Software, dass sich der Mikroskoptisch in der Lastposition befindet. Verwenden Sie Führungsschienen, um den gesamten Halter mit der Probe senkrecht nach unten in das Mikroskop zu gleiten. Drehen Sie sie so, dass die magnetische Halterscheibe einrastet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 Mikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Roth	6351.1
Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt	Sigma	A4018 oder A9414
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (MESAB/ MS-222/Tricain)	Sigma	Nr. E10521
20 μl (1 mm Innendurchmesser, schwarz markiert) Kapseln	Marke	701904	Verkauft als Ersatzteil für Transferpettor
Kolben mit Teflonspitze für 20 μl Kapillaren	Marke	701932	Verkauft als Ersatzteil für Transferpettor