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>1. Vorbereitung von Embryonen
- Nach der Paarung werden die Embryonen in E3 in einer Petrischale entnommen und vor dem Aufsteigen bei 26,5 °C ca. 28 h inkubiert.
Anmerkung: Dadurch wird die Entwicklung der Embryonen verlangsamt, so dass sich die Embryonen zu Beginn der Bildgebung etwa im 30. Somitenstadium befinden.
- Betäuben Sie Embryonen in 0,016-0,020% Tricain in E3. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie PTU bis zu einer Konzentration von 200 μM hinzu.
- Entchorionieren Sie die Embryonen mit einer Pinzette unter einem Präpariermikroskop. Greifen Sie mit zwei Pinzetten das Chorion und ziehen Sie es vorsichtig auseinander, um den Embryo freizugeben.
>2. Montage in Agarose
HINWEIS: Die entwickelte Einbettungsmethode erfordert je nach Bedarf zwei verschiedene Konzentrationen von Low-Melt-Agarose in E3 mit 0,02% Tricain und PTU. Die erste Agaroselösung enthält eine optimale Konzentration von Agarose, bei der die Verzerrung und Motilität auf ein Minimum reduziert sind. Die Optimierung wird in Schritt 5 unten beschrieben.
- Die Agaroselösungen für die beiden Schichten (Konzentration definiert in Schritt 5 und 1%) auf 65 °C erhitzen. Lassen Sie die Agarose kurz vor dem Aufsetzen auf ca. 30 °C abkühlen, damit der Embryo nicht durch die Hitze geschädigt wird. Für die Montage verwenden Sie 35-mm-Glasbodenschalen mit einem abgedeckten Glasboden Nr. 0. Durch das am Boden der Schale angebrachte Deckglas entsteht eine 10 mm flache (ca. 1,2 mm tiefe) Vertiefung, in die der Embryo gelegt werden soll.
Anmerkung: In diesem Fall lagen die Konzentrationen mit der geringsten Motilität und den geringsten Verzerrungen zwischen 0,025 und 0,040 % Agarose.
- Platzieren Sie einen dechorionierten Embryo vorsichtig mit einer seiner seitlichen Seiten zum Boden der Schale, indem Sie eine Glaspipette oder Mikropipette verwenden. Wenn Sie eine Mikropipette verwenden, schneiden Sie den äußeren Teil der Spitze ab, um die Öffnung für den Embryo zu vergrößern (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig alle E3-Reste mit einer Mikropipette.
- Geben Sie die erste Agaroselösung in die kleine Vertiefung, die durch das am Boden der Schale befestigte Deckglas entsteht, um den Embryo abzudecken (Schicht 1) (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, dass die Agarose die kleine Vertiefung bedeckt, aber nicht überläuft.
- Decken Sie die kleine Vertiefung mit einem Deckglas (22 mm x 22 mm) ab (Abbildung 1C), um einen schmalen, mit Agarose gefüllten Raum mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern zu schaffen.
- Legen Sie eine Schicht 1%iger Agaroselösung auf das Deckglas auf den gesamten Boden der Schale (Schicht 2) (Abbildung 1D). Wenn sich diese Schicht verfestigt, hält sie das Deckglas an Ort und Stelle.
- Füllen Sie den restlichen Teil der Schale mit E3 mit 0,02 % Tricain, um das System mit Feuchtigkeit zu versorgen (Schicht 3) (Abbildung 1E).
Anmerkung: Bei diesem Aufbau schützen das Deckglas und 1 % Agarose die untere Schicht vor Verdünnung.
>3. Optimierung der Agaroselösung für Schicht 1
- Um die optimale Konzentration von Agarose für Schicht 1 zu identifizieren, verwenden Sie einen Multiskalen-Gittersuchansatz. Embryonen werden in steigenden Agarose-Konzentrationen von 0,01 % bis 1 % montiert, gefolgt von Zeitrafferaufnahmen der Wachstumseinschränkung und Beweglichkeit des Embryos im Sichtfeld. Identifizieren Sie die Konzentrationen, bei denen sowohl die Verzerrung als auch die Motilität auf ein Minimum reduziert sind.
- Um die Agarosekonzentration weiter zu optimieren, mounten Sie die Embryonen mit einem feineren Konzentrationsbereich von Agarose (z. B. zwischen 0,025 und 0,040 % Agarose), abhängig von der Konzentration, die in Schritt 3.1 als am besten befunden wurde (z. B. 0,025 %, 0,028 %, 0,031 % usw.).
Anmerkung: In unserem Labor lag die optimale Agarosekonzentration bei etwa 0,03 %.
