$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Mikroskopeinrichtung, Bildaufnahme, -verarbeitung und -analyse
- 0,8 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) zubereiten: 0,8 g LMP Agarose auf 100 ml E3 geben und erhitzen, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Im heißen Zustand aliquotiert 1 ml LMP-Agarose in 1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen in einem 37 °C heißen Heizblock. Die LMP-Agarose bleibt bei 37 °C geschmolzen. Geben Sie 40 μl 4 mg/ml (25x), pH 7,0 Tricain zu jedem 1 ml Aliquot LMP-Agarose bei 37 °C. HINWEIS: Wenn Sie mit einem pigmentierten Stamm arbeiten, fügen Sie 20 μl 0,15 % (50x) PTU zu jedem 1 ml Aliquot hinzu.
- Die restliche LMP-Agarose wird mehrere Monate lang in verschlossenen 50-ml-Röhrchen bei 4 °C gelagert.
- Anästhesieren Sie parabiotische Embryonen, die abgebildet werden sollen, indem Sie 1 ml 4 mg/ml (25x), pH 7,0 Tricain zu den 25 ml E3 hinzufügen, in denen sich die Embryonen bereits befinden.
- Schwenken Sie die Schale vorsichtig, so dass sich die Embryonen in der Mitte sammeln. Ziehen Sie dann mit einer Kunststoff-Transferpipette mit breiter Spitze die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich auf. Drehen Sie die Pipette aufrecht und hüpfen Sie die Embryonen vorsichtig auf, so dass sie sich ganz unten in der Pipette absetzen.
- Wenn sich die Embryonen am Boden der Pipette befinden, übertragen Sie sie auf ein 1 ml Aliquot LMP Agarose, indem Sie die Pipettenspitze leicht mit der Oberfläche der Agarose berühren. Vermeiden Sie das Umfüllen von überschüssiger Flüssigkeit, da dies die Agarose verdünnt.
- Nachdem Sie die überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette ausgestoßen haben, verwenden Sie die Pipette, um die Embryonen vorsichtig in der Agarose zu mischen, und übertragen Sie dann mit der Pipette alle Agarose und Embryonen in die Vertiefung eines Glasbodens (Deckglas Nr. 1,5), 6-Well-Platte.
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Pipette zu entsorgen, nachdem Sie die Embryonen auf die Speicherfolie übertragen haben. Restliche Agarose setzt sich in der Pipette ab, wodurch sie für die weitere Verwendung unwirksam wird. Verwenden Sie stattdessen jedes Mal eine neue Pipette.
- Verwenden Sie unter einem Stereoskop eine Pipettenspitze mit Gelladefunktion, die am Ende einer Nadel mit Holzgriff befestigt ist, um die Embryonen in Richtung des Deckglases zu positionieren (um sicherzustellen, dass sie sich innerhalb des Arbeitsabstands des Mikroskopobjektivs befinden) und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung.
Anmerkung: Kontinuierlich neu positionieren, bis die Agarose vollständig ausgehärtet ist. Achten Sie darauf, dass die parabiotischen Embryonen montiert werden, je nachdem, welcher Embryo des Paares abgebildet werden soll. Aufgrund der zufälligen Ausrichtung der verbundenen Embryonen kann es bei einigen Paaren schwierig sein, beide Embryonen abzubilden. In diesem Szenario werden die Embryonen mit einer Pinzette und einer Kunststoff-Transferpipette mit breiter Spitze aus der Agarose entnommen und dann für die Bildgebung aus einer anderen Perspektive wieder montiert.
- Sobald die Agarose fest geworden ist, mit 2 - 3 ml E3 bedecken, die mit Tricain (und ggf. PTU) ergänzt wird.
- Nehmen Sie die Embryonen mit einem invertierten Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop, einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop oder einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop ab. Wählen Sie das Objektiv aus, das für die gewünschte Bildgebung am besten geeignet ist. Verwenden Sie für ein Sichtfeld des gesamten Embryos ein 4-fach-Objektiv. Wählen Sie eine höhere Vergrößerung, z. B. ein 20-faches Objektiv, um ein bestimmtes Gewebe abzubilden
Anmerkung: Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, montieren Sie LMP-Agarose (ähnlich wie oben) auf einem Glasdeckglas. Drehen Sie das Glasdeckglas auf einen Glasobjektträger, der einen Ring aus Vakuumfett hat, der mit demselben E3-Tricain-PTU gefüllt ist.
- Verarbeiten Sie aufgenommene Bilder mit kostenlosen Bildanalyse-Softwarepaketen wie NIH Image J/FIJI.
Anmerkung: Zählen Sie die Zellzahl und quantifizieren Sie Dynamiken wie Zellmigration und Zellteilung mithilfe von Segmentierungs- und Tracking-Algorithmen.