1: Zwei-Photonen-Axotomie mit einem speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Chamäleon-Ti-Saphir-Laser
- Bereiten Sie sich auf die Bildgebung vor. Legen Sie den/die montierten Embryo(n) auf einen Objektträgerhalter unter dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Embryo mit einem 40-fachen (0,8 NA) Wasserobjektiv. Schalten Sie den Laser ein. Wir konnten GFP-exprimierende Neuronen anhand der folgenden Parameter reproduzierbar sichtbar machen und schädigen. Um Axone bei einer nicht schädigenden Leistung sichtbar zu machen, stellen Sie den Laser auf eine Wellenlänge von 910 Nanometern (nm) und eine Leistung von 30 Milliwatt ein (mW angegeben ist die Leistung an der Probe). Öffnen Sie die Imaging-Software. Wir verwenden die ScanImage-Software, die im Labor von Karel Svoboda entwickelt wurde.
- Drücken Sie den Fokus, um den Embryo mit dem Zwei-Photonen-Laser zu scannen, lokalisieren Sie das Axon, das Sie axotomisieren möchten, und nehmen Sie ein Bild dieses Axons auf. Markieren Sie die erste und letzte Z-Position, erfassen Sie das Bild, und erstellen Sie eine maximale Projektion der Z-Stapel.
- Zoomen Sie 70x auf den Ast des Axons, den Sie axotomisieren möchten, und stoppen Sie den Scanvorgang. Erhöhen Sie die mW an der Probe auf die schädigende Leistung von 180 mW und führen Sie einen einzelnen Scan mit dem Laser durch. Dazu setzen wir die Anzahl der Z-Slices auf 1 und drücken "Grab". Dies sollte ausreichen, um das Axon zu durchtrennen. In der Diskussion finden Sie Methoden, um dieses Verfahren für Ihr Mikroskop und Ihr experimentelles Ziel zu optimieren.
- Verkleinern, die Leistung auf 30 mW reduzieren und ein Bild aufnehmen.
2: Zwei-Photonen-Axotomie am Zeiss 510 Konfokal-/Zwei-Photonen-Mikroskop
- Platzieren Sie den montierten Embryo auf dem Tisch und bringen Sie ihn mit einem 25-fachen Wasserobjektiv oder einem anderen geeigneten Objektiv in den Fokus.
- Schalten Sie die Zwei-Photonen- (910 nm) und Argon-Laser (488 nm) in einer Mehrspureinstellung ein, so dass es möglich ist, von einem zum anderen zu wechseln. Obwohl beide Laser zum Nachweis von GFP verwendet werden, wird die Zwei-Photonen-Emission mit Rot und die Argon-Laser-Emission mit Grün visualisiert, um die beiden zu unterscheiden.
- Verwenden Sie den Argon-Laser, um ein Axon zu identifizieren, das verletzt werden soll. Markieren Sie unter Z-Einstellungen den ersten und letzten optischen Abschnitt. Nehmen Sie ein konfokales Bild auf und erstellen Sie eine maximale Projektion des Z-Stapels.
- Wählen Sie die Region des Axons, die verletzt werden soll, und bringen Sie diese Region in den Fokus. Schalten Sie den Argon-Laser aus und den Zwei-Photonen-Laser ein. Scannen Sie die Probe mit dem Zwei-Photon bei einer Laserintensität von ~9% Transmission, um sicherzustellen, dass das Axon noch im Fokus ist.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", damit das Zuschneidewerkzeug verfügbar ist. Verwenden Sie Zuschneiden, um den gewünschten Bereich zu vergrößern. Normalerweise zoomen wir auf ~70X (der Zoom kann unter der Registerkarte "Modus" überprüft werden). Ändern Sie auf der Registerkarte "Kanäle" die Intensität des Zwei-Photonen-Transmissions von ~9% Transmission auf 15-20% Transmission.
- Um ein Axon zu durchtrennen, aktivieren Sie die "Fast XY"-Taste für ca. 1 Sekunde und drücken Sie dann die Stopp-Taste, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Das Axon sollte als verstreuter Trümmerhaufen angesehen werden, wenn das Verfahren funktioniert hat.
- Um sicherzustellen, dass das Axon beschädigt wurde, schalten Sie zurück auf den 488-nm-Argon-Laser, nehmen Sie ein weiteres konfokales Bild auf und erstellen Sie eine maximale Projektion.