Zebrafisch-Optogenetik: Aktivierung genetisch veränderter somatosensorischer Neuronen zur Untersuchung von Verhaltensreaktionen von Larven

Abstract

Quelle: Palanca A. M. S., et al. Optogenetische Aktivierung somatosensorischer Neuronen von Zebrafischen mit ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

Dieses Video beschreibt optogenetische Techniken, indem genetisch veränderte somatosensorische Neuronen aktiviert und die hervorgerufene Verhaltensreaktion mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet werden.

Protocol

>1. Reitlarven für Verhaltensexperimente

1. Stellen Sie 1,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzgehalt in ddH2O her und lagern Sie sie in einem 42 °C-Heizblock, um ein Verfestigen zu verhindern.
2. Mit einer Pasteur-Glaspipette wird eine der vorgesiebten Larven in ein Röhrchen mit 1,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzgehalt und so wenig blauem/embryonalem Wasser wie möglich überführt.
3. Die Larven werden in einem Tropfen Agarose auf eine kleine Petrischale gegeben.
4. Unter einem Präpariermikroskop die Larve dorsal nach oben positionieren.
5. Wenn die Agarose fest geworden ist, schneide die Agarose mit einer dünnen Rasierklinge (#11 Skalpell) ab und lasse einen Agarkeil um die gesamte Larve herum.
6. Machen Sie zwei diagonale Schnitte an beiden Seiten des Eigelbs, achten Sie darauf, dass die Larve nicht eingekerbt wird.
7. Füllen Sie den Bereich um die Agarose mit Embryo-/Blauwasser.
8. Ziehen Sie Agarose vom Rüssel und Schwanz der Larve weg (Abbildung 1).

>2 . Vorbereiten von Hochgeschwindigkeitskameras und Bildgebungssoftware

1. Montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera auf das Präparierzielfernrohr.
2. Verbinden Sie die Kamera mit dem Computer.
3. Schalten Sie den Computer ein.
4. Schalten Sie die Hochgeschwindigkeitskamera ein.
5. Offene Video-/Imaging-Software (Wir verwenden AOS-Imaging-Software und werden hier die Verfahren für deren Verwendung beschreiben, aber andere Imaging-Software ist ebenso akzeptabel).
6. Passen Sie die Kameraeinstellungen entsprechend an (z. B. 1.000 Bilder pro Sekunde (fps), 50 % Triggerpuffer oder andere bevorzugte Einstellungen).
7. Starten Sie die Aufnahme.

>3. Einzelne Neuronen mit einem 473 nm Laser aktivieren

1. Stimulator, Laser und Glasfaserkabel anbringen.
2. Schalten Sie den Stimulator ein.
3. Stellen Sie den Stimulator auf maximal 5 Volt und eine Impulsdauer von 5 ms ein.
4. Schalten Sie den Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
5. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe des Zellkörpers eines Neurons mit ChEF-tdTomato-Expression zu positionieren (Abbildung 1).
6. Geben Sie einen Impuls aus blauem Licht ab, um das sensorische Neuron zu aktivieren.
7. Zeichnen Sie das Verhalten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf, die auf 500 oder 1.000 Bilder pro Sekunde eingestellt ist.
8. Wiederholen Sie das Experiment wie gewünscht und warten Sie zwischen jeder Aktivierung 1 Minute, um eine Gewöhnung zu vermeiden. (Wir zeichnen mindestens drei Antworten für jedes Neuron auf).
9. Um die Larven freizusetzen, hebeln Sie die Agarose mit einer Pinzette auseinander und achten Sie darauf, das Tier nicht zu verletzen. Dieses Tier kann sich weiterentwickeln und das Verfahren kann in einem älteren Stadium wiederholt werden, um die Entwicklung des Verhaltens zu charakterisieren. Der Embryo kann auch für eine hochauflösende konfokale Bildgebung der aktivierten Zelle wieder montiert werden, um das Verhalten mit der Zellstruktur zu korrelieren, wie unten beschrieben.
10. Übertragen Sie die Larve auf eine Kulturplatte mit frischem Blau-/Embryowasser. Wir verwenden eine 24-Well-Platte, um den Überblick über die einzelnen Larven zu behalten.

Results

Abbildung 1. Diagramm einer montierten Zebrafischlarve und repräsentativer Neuronen, die an der Berührungsreaktion der Larven beteiligt sind. Zebrafischlarven wurden teilweise in 1,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzgehalt montiert (dargestellt durch gestrichelte Linien, die den rostralen Teil der Larve umgeben). Ein Trigeminusneuron (im Kopf) und ein Rohon-Beard-Neuron (im Rumpf) sind in Rot dargestellt. Mauthner-Zelle...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt Agarose	Sigma	Nr. A9045	oder gleichwertig
Petrischale (100x15 mm)	jegliche	jegliche
Unsterile Skalpellklingen	Feine wissenschaftliche Werkzeuge, Inc.	Artikel-Nr.: 10011-00	oder gleichwertig
blaues/embryonales Wasser			10 L ddH2O 0,6 g Instant Ocean 6 Tropfen Methylenblau
Hochgeschwindigkeits-Kamera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	oder gleichwertig
Glas-Pasteur-Pipette	Fischer	Artikel-Nr.: 1367820B	oder gleichwertig (10-15 mm Durchmesser)
473 nm tragbarer Laser	Kristalllaser	Artikel-Nr.: CL-473-050	oder höhere Leistung, mit TTL-Option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Geschäftsbereich Grass Instrument	S48K	oder gleichwertig
Tricain	Sigma	Nr. A5040
200 μm optische Faser	ThorLabs (Englisch)	AFS200/220Y-KUNDENSPEZIFISCH	Patchkabel, Länge: 3 m, Ende A: FC/PC, Ende B: FC/PC, Mantel: FT030
50 μm optische Faser	ThorLabs (Englisch)	AFS50/125Y-CUSTOM	Patchkabel, Länge: 3 m, Ende A: FC/PC, Ende B: FC/PC, Mantel: FT030
24 Kulturplatten	Genesee	Nr. 25-102	oder gleichwertig