Dissektion von Augenlinsen: Eine Technik zur Beobachtung der Morphologie von Zebrafischlinsen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Vorontsova I. et al, Bewertung der Lokalisation des Zebrafischlinsenkerns und der Suturalintegrität. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt das Protokoll, das entwickelt wurde, um adulte und larvale Zebrafischlinsen zu präparieren, um die kortikale Linsenmorphologie und strukturelle Integrität der Linsennähte zu analysieren.

Protokoll

>1. Sezieren von Zebrafischlarven und adulten Zebrafischlinsen

Betäuben Sie Fische von 6 dpf Larven bis zum Erwachsenenalter mit Tricain, bis sie nicht mehr auf Berührungen reagieren, aber immer noch einen starken Herzschlag zeigen. Messen Sie die Standardlänge der Fische nach Schilling (2002) für die Inszenierung.
Sofort die Augen mit einer Mikrodissektionsschere herausschneiden und in eine Sezierschale bei PBS legen (Abbildung 1 für erwachsene Augen gezeigt).
1. Stellen Sie eine benutzerdefinierte 35-mm-Schale her, die mit Silikon gefüllt ist, um Linsen zu dissektionieren. Sobald das Silikon ausgehärtet ist, schneiden Sie eine Vertiefung mit einem Durchmesser von etwa 2-3 mm und einer Tiefe von 0,5 mm heraus, um die Augen/Linsen von Erwachsenen während der Dissektion zu immobilisieren.
Präparierung von adulten Zebrafischlinsen
1. Setzen Sie ein Erwachsenenauge mit der hinteren Seite nach oben in die mit PBS gefüllte Schale ein. Ruhigstellen Sie das Auge ruhig, indem Sie eine Pinzette in einem Winkel von <45° durch die Sehscheibe einführen. Achten Sie darauf, das Objektiv nicht einzukerben oder zu komprimieren. Machen Sie mit einer Präparierschere zwei oder drei radiale Schnitte durch Netzhaut und Sklera von der Sehscheibe bis zur Ziliarzone.
2. Schälen Sie die Netzhaut und die Sklera wie Blütenblätter ab und drehen Sie das Auge mit der Hornhautseite nach oben. Immobilisieren Sie die Linse indirekt durch Manipulation der Sklera und der Hornhaut mit der flachen Seite der Schere, während Sie die Netzhaut und das anhaftende Gewebe mit einer Pinzette wegziehen. Schneiden Sie überschüssiges Gewebe vorsichtig von der Linse ab.
  Anmerkung: Es ist wichtig, sorgfältig zu präparieren, um gleichbleibend gesunde Linsen zu erhalten.
Sezieren von Zebrafisch-Larvenlinsen
1. Legen Sie ein Larvenauge mit der hinteren Seite nach oben auf den flachen, mit PBS gefüllten Teil der Silikonschale und verwenden Sie eine angespitzte Wolframnadel, um radiale Schnitte durch die Netzhaut und die Sklera zu machen, während Sie das Auge mit einer anderen Wolframnadel oder -zange ruhigstellen.
  Anmerkung: Achten Sie darauf, das Objektiv nicht zu beschädigen.
  1. Die Spitze eines 2 cm langen 0,1 mm Wolframdrahtes wird elektrolytisch geschärft, indem die Drahtspitze in 10 % (w/v) NaOH aufgehängt und ein Niederspannungswechselstrom angelegt wird14. Befestigen Sie die Nadel in einer Pasteurpipette, indem Sie das Glasende mit einem Bunsenbrenner schmelzen.
    Anmerkung: Alternative Feindissektionswerkzeuge können ebenfalls verwendet werden.
    Vorsicht: NaOH ist korrosiv.
2. Schöpfen Sie die Linse vorsichtig mit einer stumpfen Seite der Nadel aus dem dissoziierten Auge heraus und ziehen Sie anhaftendes Gewebe vorsichtig ab.

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Ergebnisse

Mikroskopbilder für Fischaugen-Seziermikroskope; Vorder-/Hinteransichten, Entfernung der Linse, 2 mm Maßstabsleisten.
Abbildung 1: Dissektion der Zebrafisch-Linse. (A) Die Augen werden von anästhesierten Fischen präpariert und mit der hinteren Seite nach oben (B) platziert. (C) Die Augen werden durch eine Pinzette über die Papille (od) ruhiggestellt und zwei bis drei radial...