Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Roy, B., et al. Patch Clamp Aufnahmen von embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen. J. Vis. Exp. (2013).

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Protokoll

1. Patch Clamp-Aufnahme (Ganzzellen-Modus)

1. Alle Aufnahmen werden im Ganzzellen-Patch-Clamp-Modus durchgeführt. Die Aufnahmekammern werden in einem elektrophysiologischen Aufbau auf einem Mikroskoptisch platziert. Unsere Tische sind fest und das aufrechte Patch-Clamp-Mikroskop wird mit einer beweglichen Mikroskopplattform oder einem Mikroskop-Translator verschraubt.
2. Die Patch-Clamp-Pipetten werden an einem horizontalen Abzieher (P-97; Sutter Instruments Co.) aus dünnwandigem Borosilikatglas, das aus WPI gewonnen wird. Die Durchmesser der Pipettenspitze liegen in der Größenordnung von 0,2 bis 0,4 μm nach dem Feuerpolieren zu einer glatten Kante, und der Schaftkegel ist ~4 mm lang.
3. Befestigen Sie die Pipette an der Kopfstufe des Verstärkers in der Elektrophysiologie-Einrichtung. Es ist wichtig, den Kopftisch in einem Winkel von ca. 45° zur horizontalen Achse zu halten, da dies einen Eintrittswinkel für die Pipette gewährleistet, der für die Bildung von hochohmigen Dichtungen auf der Mauthner-Zelle geeignet ist.
4. Üben Sie kurz vor dem Betreten der Badlösung einen kleinen Überdruck auf die Pipette aus, um die Gefahr einer Verschmutzung der Spitze zu verringern. Bei der Aufzeichnung von mEPSCs enthalten Badlösungen 1 μM TTX zur Blockierung von Aktionspotentialen, 5 μM Strychnin zur Blockierung von Glycinrezeptoren und 10 μM Bicuculline oder 100 μM Picrotoxin zur Blockierung von GABAA-Rezeptoren. Bei der Aufzeichnung von mIPSCs enthalten Badlösungen 1 μM TTX, Kynurensäure und entweder Bicucullin oder Strychnin, abhängig von der interessierenden Rezeptoraktivität.
5. Nähern Sie sich der M-Zelle mit einem kleinen Überdruck in der Pipette. Durch den Überdruck wird die Zelle sanft von einer Seite zur anderen geschoben und bildet sich, wenn sie unmittelbar über der Zelle positioniert wird, ein kleines Grübchen auf der Zellmembran. Lassen Sie die Pipette einige Sekunden lang an Ort und Stelle, um die Zelloberfläche sanft zu reinigen, damit eine starke Abdichtung zwischen Pipette und Membran gebildet werden kann. Durch das Ablassen des Überdrucks in der Pipette kann die Versiegelung eingeleitet werden, und ein geringer Unterdruck in Verbindung mit negativen Pipettenpotentialen führt dazu, dass sich innerhalb weniger Sekunden GigaΩ-Dichtungen bilden.
6. Ändern Sie das Haltepotenzial am Verstärker auf -60 mV. Reißen Sie die Zellmembran mit einer Reihe kurzer Saugimpulse auf. Erfassen Sie Membranpotentiale sofort und minimieren Sie Kapazitätsartefakte. Kompensieren Sie die Zellkapazität (Cm) und den Zugangswiderstand (Ra) (Ra) um 70-85%. Ra sollte routinemäßig alle 30 Sekunden bis zu einer Minute überwacht werden, und wenn es eine Änderung von 20 % oder mehr gibt, brechen Sie das Experiment ab.
7. Sobald das Experiment beendet ist und genügend Daten gesammelt wurden, wird das Präparat geopfert, indem das Hinterhirn mit einer Pinzette entfernt wird. An dieser Stelle kann die Datenanalyse beginnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pipetten-Abzieher	Sutter Instruments Co	P-97
Aufrechtes Patch-Clamp-Mikroskop	Leica Mikrosysteme	DMLFSA
Verstärker	Molekulare Bauelemente	200 Mrd.
Mikromanipulator	Siskiyou Inc.	MX7500