Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

- Legen Sie zunächst eine Aufnahmekammer mit einer Probe in einer Badlösung, deren Zusammensetzung der physiologischen extrazellulären Umgebung oder dem Zytoplasma entspricht, auf einen Mikroskoptisch. Schieben Sie die Aufzeichnungsmikropipette, eine Pipette mit einer Silberelektrode, die in einer Elektrolytlösung gebadet ist, die die intrazellulären Bedingungen nachahmt, durch Anlegen von positivem Druck in Richtung des Neurons und nehmen Sie Kontakt mit der Zellmembran auf.

Wechseln Sie vorsichtig von Über- auf Unterdruck, um eine dichte Abdichtung zwischen der Membran und der Pipette zu bilden. Stellen Sie ein Haltepotenzial am Verstärker ein, um die Zelle auf einer konstanten Spannung zu halten. Dann brechen Sie die Zellmembran innerhalb der Mikropipette durch Saugen auf.

Sobald die Zellmembran reißt, bewirkt das Haltepotential, dass Ionen durch spannungsgesteuerte Ionenkanäle fließen, wodurch ein Membranpotential entsteht, das von der Aufzeichnungselektrode aufgezeichnet wird. Erfassen Sie sofort das Membranpotential. Die Aufzeichnungselektrode überträgt das Signal an den Rückkopplungsverstärker, der das Membranpotential vom Haltepotenzial subtrahiert - ein Oszilloskop, das eine visuelle Anzeige des Membranpotentials darstellt, und einen Computer. Im folgenden Protokoll werden wir eine Patch-Clamp-Messung an der Mauthner-Zelle in einem Zebrafischembryo durchführen.

- Um sich auf das Patch-Clamping vorzubereiten, ziehen Sie zunächst einige Patch-Clamp-Pipetten mit dünnwandigem Borosilikatglas in einen horizontalen Abzieher. Die Durchmesser der Pipettenspitze betragen nach dem Feuerpolieren etwa 0,2 bis 0,4 Mikrometer zu einer glatten Kante, und der Schaftkegel ist etwa 4 Millimeter lang.

Füllen Sie die Pipettenspitze mit intrazellulärer Lösung, indem Sie die Spitze in die intrazelluläre Flüssigkeit tauchen. Führen Sie dann eine Spritzennadel in die Pipette ein und scheiden Sie die intrazelluläre Lösung vorsichtig aus der Spritze aus, um die Pipette vollständig zu füllen. Befestigen Sie die Pipette an der Kopfstufe des Verstärkers in der Elektrophysiologie-Einrichtung. Es ist wichtig, den Kopftisch in einem Winkel von ca. 45 Grad zur horizontalen Achse zu halten, da dies einen Eintrittswinkel für die Pipette gewährleistet, der für die Ausbildung von hochohmigen Dichtungen mit der Mauthner-Zelle geeignet ist.

Kurz bevor die Pipette in die Badlösung absinkt, üben Sie eine kleine Menge Überdruck auf die Pipette aus, um die Wahrscheinlichkeit eines Blockierens der Spitze zu verringern. Nähern Sie sich der M-Zelle weiter mit einem kleinen Überdruck in der Pipette. Durch den Überdruck wird die Zelle sanft von einer Seite zur anderen geschoben und bildet sich, wenn sie unmittelbar über der Zelle positioniert wird, ein kleines Grübchen auf der Zellmembran.

Lassen Sie nun die Pipette einige Sekunden an Ort und Stelle, um die Zelloberfläche sanft zu reinigen, damit eine starke Abdichtung zwischen Pipette und Membran gebildet werden kann. Lassen Sie dann den Überdruck in der Pipette ab, um die Versiegelung einzuleiten. Ein geringer Unterdruck in Verbindung mit einem negativen Pipettenpotenzial führt dazu, dass sich innerhalb weniger Sekunden Giga-Ohm-Dichtungen bilden.

Ändern Sie anschließend das Haltepotenzial im Verstärker auf minus 60 Millivolt. Reißen Sie die Zellmembran mit einer Reihe kurzer Saugimpulse auf. Erfassen Sie dann sofort Membranpotentiale und minimieren Sie Kapazitätsartefakte. Kompensieren Sie die Zellkapazität und den Zugriffswiderstand um 70 % bis 85 %.

Der Zugangswiderstand sollte alle 30 Sekunden bis zu einer Minute überwacht werden, und wenn es eine Änderung von 20 % oder mehr gibt, brechen Sie das Experiment ab. Sobald das Experiment beendet ist und genügend Daten gesammelt wurden, opfern Sie den Embryo, indem Sie das Hinterhirn mit einer Pinzette entfernen.