Intramuskuläre (IM) Injektion: Verabreichung von Verbindungen in den Rückenmuskel eines erwachsenen Zebrafisches

Zusammenfassung

Quelle: Myllymäki, H., et al. Immunisierung von adulten Zebrafischen für das präklinische Screening von DNA-basierten Impfstoffen. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt die Technik der intramuskulären Injektion zur Abgabe von Verbindungen in die Rückenmuskulatur eines erwachsenen Zebrafisches.

Protokoll

1. Injektion des DNA-Impfstoffs und Elektroporation

1. Verwenden Sie für Impfungen nach diesem Protokoll gesunde, 6 bis 12 Monate alte erwachsene Zebrafische. Halten Sie die Fische in einem Durchflusssystem mit einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 14/10 Stunden, mit maximal sieben Fischen pro 1 l Wasser.
2. Bereiten Sie eine 0,02%ige 3-Aminobenzoesäure-Ethylester-Lösung (Tricain) (pH 7) im Aquarienwasser vor, um den Fisch zu betäuben. Verwenden Sie eine 10 cm Petrischale oder etwas Ähnliches.
3. Bereiten Sie einen Rückgewinnungstank vor, indem Sie ein 5-Liter-Becherglas mit 3 l sauberem Systemwasser füllen.
4. Bereiten Sie ein Impfpolster vor, um den Fisch während der Impfung in einer festen Position zu halten. Nehmen Sie ein 5 x 7 cm^{großes 2} Stück eines 2 bis 3 cm dicken Schwammes. Schneiden Sie mit einer Skalpellklinge oder einer scharfen Schere eine Rille in den Schwamm.
   Anmerkung: Derselbe Impfaufsatz kann in mehreren Experimenten verwendet werden. Desinfizieren Sie den Schwamm zwischen den Versuchen, indem Sie ihn in 70%igem Ethylalkohol einweichen und trocknen lassen.
5. Weichen Sie den Schwamm gründlich im Systemwasser ein und legen Sie den Schwamm auf eine Petrischale.
6. Fasten Sie den Fisch 24 h vor den Impfungen.
7. Betäuben Sie einen Zebrafisch, indem Sie ihn auf eine Petrischale legen, die 0,02 % Tricain enthält. Warten Sie, bis der Fisch nicht auf die Berührungsstimulation reagiert und sich die Kiemen nicht mehr bewegen. Betäuben Sie jeweils einen einzelnen Fisch.
8. Übertragen Sie den betäubten Zebrafisch mit einem Plastiklöffel auf den nassen Schwamm und setzen Sie die Bauchseite des Fisches nach unten in die Rille ein. Achten Sie in der richtigen Position darauf, dass sich der Kopf und der größte Teil des Körpers des Fisches in der Rille befinden und die Rückenflosse und der Schwanz aus der Rille herausragen.
9. Platzieren Sie die Nadel unter dem Mikroskop vorsichtig in einem Winkel von etwa 45° nahe dem Rückenmuskel des Zebrafisches, indem Sie die Feinabstimmungsräder der x- und y-Achse am Mikromanipulator verwenden.
10. Finde die kleine Stelle ohne Schuppen vor der Rückenflosse, an der das Drücken der Nadel keine Kraft erfordert. Wenn Widerstand zu spüren ist, versuchen Sie es mit einer angrenzenden Stelle. Vermeiden Sie Verletzungen der Wirbelsäule, der Rückenflosse oder der Schuppen.
    Anmerkung: Wenn sich die Nadel beim Drücken verbiegt, kürzen Sie die Nadel leicht, indem Sie sie abschneiden.
11. Verwenden Sie den Fußschalter, um die Impflösung nach und nach in den Muskel zu injizieren. Beobachten Sie die Injektion durch das Mikroskop: Phenolrot ist sichtbar, wenn es in das Muskelgewebe eindringt. Passen Sie bei Bedarf die Dauer des Impulses an.
    Anmerkung: Alternativ können Sie für die Einspritzung die Impulsgebertaste an der Vorderseite der Pneumatikpumpe verwenden. Die Verwendung eines ferngesteuerten Fußschalters ermöglicht es jedoch, mit der anderen Hand die Impulslänge über das 10-Dreh-Rad einzustellen. Vermeiden Sie es, die Lösung zu schnell zu injizieren, da dies zu übermäßigen Gewebeschäden führen kann. Achten Sie darauf, keine Luft einzublasen.
12. Elektropopolieren Sie den Fisch sofort nach der Injektion. Stellen Sie sicher, dass der Fisch noch unter Narkose steht. Halten Sie den Fisch auf dem Schwamm und legen Sie den Fisch zwischen eine Pinzette, so dass sich die Elektroden auf jeder Seite der Injektionsstelle befinden. Drücken Sie die Elektrodenpinzette nicht zu fest, sondern halten Sie beide Elektroden in Kontakt mit dem Fisch.
    1. Drücken Sie die Starttaste am Elektroporator, um sechs Impulse mit 40 V und 50 ms abzugeben.
    2. Bringen Sie den Fisch vorsichtig in das Auffangbecken.
    3. Reinigen Sie die Elektroden nach jeder Elektroporation, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen.
       Anmerkung: Überwachen Sie sorgfältig das Wohlbefinden der Fische nach der Impfung. Euthanasieren Sie alle Fische, die Anzeichen von Unwohlsein zeigen (langsame Erholung von der Narkose, abweichendes Schwimmen, Keuchen) in 0,04% Tricain. Nach der Genesung wird der Fisch in die Durchflusseinheit umgefüllt und normal gefüttert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Phenolrotes Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 114537-5G
Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz)	Sigma	A5040-100g	Anästhesie- und Euthanasielösung
Pinzetten Elektroden (7 mm) Sets	BTX Harvard-Apparat	BTX 450165	Elektroden vom Typ Pinzette
Aluminiumsilikat-Kapillaren	Harvard-Apparatur	Nr. 30-0108
Mikromanipulator	Narishige	MA-153
Mikroskop	Olymp	ZS61
ECM Elektro Quadratischer Porator	BTX Harvard-Apparat	BTX ECM 830
Plastiklöffel
Schwamm
Werkbank aus Styropor