Mikroinjektion von Embryonen: Eine Technik, um eine Verbindung in das Eigelb des Zebrafisches zu bringen

Zusammenfassung

Quelle: Sorlien, E. L., et al. Effiziente Produktion und Identifizierung von CRISPR/Cas9-generierten Gen-Knockouts im Modellsystem Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt eine Technik der Embryo-Mikroinjektion, um Verbindungen in den Dottersack des Zebrafisches zu bringen.

Protokoll

1. Mikroinjektion von CRISPR-Komponenten in Zebrafischembryonen

1. Richten Sie in der Nacht vor der Injektion Aufzuchtbecken ein, indem Sie die gewünschte Anzahl von Männchen und Hündinnen (typischerweise 2 Hündinnen und 1 oder 2 Männchen) in ein Aufzuchtbecken mit einer Trennwand legen.
2. Bereiten Sie eine Mikroinjektionsplatte mit 1,5 % Agarose in 1x E3-Medium (siehe Materialtabelle) mit 0,01 % Methylenblau (einem Fungizid) vor, indem Sie 35 mL der geschmolzenen Agarose in eine 10 cm große Petrischale gießen und vorsichtig eine Kunststoffform verlegen, um keilförmige Tröge in die Lösung zu erzeugen, und die Form anklopfen, um Luftblasen zu entfernen.
3. Lassen Sie die Agarose fest werden und lagern Sie die Schale mit einer kleinen Menge Medium und in Paraffinfolie eingewickelt, damit die Platte bei 4 °C nicht austrocknet.
   Anmerkung: Injektionsplatten sind mehrere Wochen lang wiederverwendbar, bis sich die Vertiefungen verformen oder trocknen oder die Platte anfängt, Schimmel zu bilden.
4. Tauen Sie am Morgen der Injektion die gereinigte sgRNA und das Cas9-Protein auf Eis auf. Denken Sie daran, alle Materialien mit Handschuhen zu handhaben, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden und RNase-freie Spitzen und Schläuche zu verwenden.
5. Erzeugen Sie eine 5-μl-Injektionslösung, indem Sie das Cas9-Protein und die sgRNA in einem 2:1-Verhältnis von Cas9:sgRNA kombinieren, um Endkonzentrationen von 400 pg/nL Cas9-Protein und 200 pg/nL sgRNA zu erhalten. Inkubieren Sie die Cas9/sgRNA-Lösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit Cas9 und sgRNA einen Ribonukleoproteinkomplex bilden können. Fügen Sie 0,5 μl 2,5 % Gew./vol Phenolrotlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und RNasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 5 μl.
   Anmerkung: Es wurde gezeigt, dass die Ionenstärke der Lösung die Löslichkeit des Cas9/sgRNA-Komplexes beeinflusst, daher kann die Zugabe von KCl die Schneideffizienz von sgRNAs erhöhen, die eine geringe Indelbildung aufweisen.
6. Stellen Sie eine Injektionsnadel her, indem Sie mit einem Mikropipettenabzieher an einer 1,0 mm Glaskapillare ziehen. Schneide die Spitze der frisch hergestellten Nadel mit einer neuen Rasierklinge oder Pinzette ab, um eine abgewinkelte Öffnung zu erhalten, die den Chorion- und Dottersack leicht durchstechen lässt.
7. Platzieren Sie die Nadel bei eingeschalteter Luftquelle in einem Mikromanipulator, der an einem Mikroinjektor befestigt ist. Unter einem Lichtmikroskop wird der Injektionsdruck unter Verwendung der für die für das jeweilige Gerät bestimmten Kalibrierung geeigneten Vergrößerung so lange eingestellt, bis die Nadel gleichmäßig eine 1 nL-Lösung in eine mit Mineralöl gefüllte Petrischale ausstößt.
   Anmerkung: Die Qualität der Nadel ist entscheidend. Üben Sie, eine Nadel herzustellen und in den Dottersack von Embryonen zu injizieren, bis Sie diese Fähigkeit beherrschen, bevor Sie weitere Experimente durchführen.
8. Entfernen Sie die Trennwand und lassen Sie die Fische ca. 15 Min.
   Anmerkung: Längere Brutzeiten produzieren mehr Embryonen, jedoch sollte die Injektion abgeschlossen werden, während sich die Embryonen im 1-Zell-Stadium befinden, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass das Cas9-Schneiden früh stattfindet und somit das genetische Mosaik verringert wird. Embryonen können in späteren Stadien (2-4 Zellstadien) injiziert werden, was jedoch möglicherweise die Keimbahnübertragungsrate des modifizierten Allels verringern kann.
9. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb und spülen Sie sie in eine 10 cm Petrischale mit 1x E3-Medium mit 0,0001% Methylenblau ab. Untersuchen Sie die Gesundheit der Eier unter dem Lichtmikroskop und entfernen Sie alle unbefruchteten Eier und Ablagerungen.
10. Legen Sie 10–15 Embryonen als nicht injizierte Kontrolle in eine separate, beschriftete Petrischale.
11. Mit einer Transferpipette die Eier vorsichtig auf der auf Raumtemperatur erwärmten Injektionsplatte ausrichten.
12. Injizieren Sie unter einem Präpariermikroskop bei 2,5-facher Vergrößerung 1 nL der Lösung in den Dottersack jedes Embryos, um insgesamt 400 μg Cas9-Protein und 200 μg sgRNA zu injizieren><. Anmerkung: Um den Schnitt zu erhöhen, falls gewünscht oder erforderlich, erhöhen Sie die Endkonzentration des Cas9-Proteins auf 800 pg/nL und der sgRNA auf 400 pg/nL in der Injektionslösung. Dies kann jedoch auch das Off-Target-Schneiden erhöhen und/oder die Gesundheit der Embryonen beeinträchtigen. Die Schneideffizienz kann auch durch direkte Injektion in die Zelle gesteigert werden. Die Injektion in den Dottersack ist jedoch technisch weniger anspruchsvoll und ermöglicht einen ausreichenden Schnitt, um Fische mit hoher Keimbahnübertragung zu erzeugen (>70 % der Nachkommen enthalten ein modifiziertes Allel).
13. Geben Sie die injizierten Embryonen in eine ordnungsgemäß beschriftete Petrischale, bedecken Sie sie mit 1x E3-Medium mit Methylenblau und legen Sie sie in einen auf 28 °C eingestellten Embryoinkubator.
14. 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) überprüfen Sie die Gesundheit der injizierten Embryonen, entfernen Sie tote oder sich abnormal entwickelnde Individuen und wechseln Sie das Medium (siehe Abbildung 1). Überprüfen Sie die Überlebensrate im Vergleich zur nicht injizierten Kontrolle.
    Anmerkung: Wenn auf ein nicht essentielles Gen abzielt, wird eine Letalität von weniger als 10 % im Vergleich zur nicht injizierten Kontrolle erwartet. Wenn in den Guide-injizierten Populationen im Vergleich zu den nicht injizierten Populationen erhöhte Letalitätswerte beobachtet werden, kann dies darauf hindeuten, dass das Zielgen für die Entwicklung essentiell ist oder dass Off-Target-Effekte zu einem Entwicklungsversagen führen. Es kann notwendig sein, die Menge der injizierten CRISPR-Reagenzien zu reduzieren, oder es kann die Generierung einer neuen sgRNA mit reduzierten Off-Target-Effekten erforderlich sein.
15. Bringen Sie die Embryonen wieder in den Inkubator und züchten Sie die Embryonen weiter auf 72 hpf, wobei Sie das Medium täglich wechseln, um die Gesundheit der Embryonen zu erhalten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Vergleich des Gesundheitszustands von 24 hpf-injizierten Embryonen. Ein lebender Embryo (A), der sich auf 24 hpf entwickelt hat, ist leicht von einem Embryo zu unterscheiden, dessen Entwicklung abgebrochen wurde (B). Embryonen, die (B) ähneln oder drastisch veränderte Merkmale von (A) aufweisen, wie z.B. eine Krümmung der Wirbelsäule oder eine veränderte Kopf- und Augenentwicklung, sollten aus der Schale ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RNase-freies Wasser	Jede Marke		Synthese von Guide-RNAs. Thermo Fisher und Qiagen tragen beide geeignetes Wasser.
E3-Medien für Embryonen	Hergestellt im Haus		Medien für die Aufzucht von Embryonen und Herstellung von Injeciton Plate. Rezept: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
Methylenblau	Sigma-Aldrich	M9140	Zugabe zu 1x E3-Medien, um Pilzwachstum auf Embryonen zu verhindern.
Petrischale	Thermo Fischer	FB0875711Z	Lagerung von Embryonen, gegossene Injektionsplatte
Agarose	Denville	CA3510-8	Gießen einer Injektionsplatte, Agarosegele.
Mikroinektion-Form	Adaptive wissenschaftliche Werkzeuge	TU-1	Schaffung von Vertiefungen, um Embryonen während der Injektion zu halten
Phenolrot	Sigma-Aldrich	Nr. P0290	Farbstoff zur Visualisierung der Injektion
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	Zur Kalibrierung des Nadelinjektionsvolumens.
Transfer-Pipetten	Jede Marke		Bewegende Embryonen
Rasierklinge	Thermo Fischer	Nr. 11295-10	Injektionsnadel schneiden, Schwanz abschneiden erwachsene Fische.
Brutkasten			Halten der Embryonen bei 28,5 °C.
Vertikaler Pipettenabzieher	David Kopf Instrumente	700C	Geneate Nadeln für die Injektion. Zusätzliche Anweisungen zum Ziehen der Nadel: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
Kapillarrohre	Sutter Instrumente	BF100-58-10	Geneate Nadeln für die Injektion.
Microloader-Tipps	Eppendorf	930001007	Laden Sie die Lösung in die Injektionsnadeln
Mikroinjektor	Welt Präzisionsinstrumente	PV 820	Injektion von Embryonen.
Präpariermikroskop	Leica		Injektion von Embryonen.
Mikrowelle	Jede Marke		Gießen einer Injektionsplatte, Agarosegele.
Maßstab	Jede Marke		Gießen einer Injektionsplatte, Agarosegele.
Handschuhe	Jede Marke		Für alle Aspekte des Protokolls.
N2	Jede Marke		Um Flüssigkeit aus der Kapillare für die Embryoneninjektion auszustoßen
PCR-Streifen-Röhrchen	Jede Marke		Für alle Aspekte des Protokolls.
200 μL Spitzen	Jede Marke		Für alle Aspekte des Protokolls.
10 μL Spitzen	Jede Marke		Für alle Aspekte des Protokolls.
Mikropipetten	Jede Marke		Für alle Aspekte des Protokolls.