Zebrafisch-Xenotransplantat (zPDX): Ein Krebsmodell

Zusammenfassung

Quelle: Wang L. et. al., Patientenabgeleitetes heterogenes Xenotransplantatmodell von Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Verwendung von Zebrafischlarven als Wirte für die vergleichende Arzneimittelbewertung. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Erstellung eines von Zebrafisch-Patienten abgeleiteten Xenotransplantat-Modells. Im Probenprotokoll beurteilen wir die Wirksamkeit der Medikamente Gemcitabin und Navitoclax am Xenotransplantatmodell des Pankreastumors.

Protokoll

>1. Injektion von gemischter Zellsuspension in den Zebrafisch

1. Zur Betäubung der Zebrafischlarven 10x Tricainlösung in E3-Wasser geben und die Larven (aus Schritt 2.3) in die mit modifiziertem E3 gefüllte Injektionsplatte (E3 mit 1 g/L Glukose und 5 mmol/L L-Glutamin) überführen.
2. Füllen Sie 25 μl gemischte Zellsuspension in die Mikrokapillarnadel und führen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsmanipulator ein.
3. Stellen Sie den Einspritzdruck und die Einspritzzeit ein. Injizieren Sie 50-80 Zellen (~8 nL) in den Dottersack von 48 hpf Zebrafisch.

>2. Kultur des xenotransplantierten Zebrafisches (zPDX-Modell)

1. Die nach der Xenotransplantation gespendeten Zebrafischlarven werden in 40 ml Mischlösung (E3-Lösung mit 1 g/l Glukose und 5 mmol/l L-Glutamin) bei 32 °C überführt.

>3. Verabreichung von Medikamenten an den xenotransplantierten Zebrafisch und die Beurteilung der Lebensfähigkeit von Tumorzellen/Fibroblasten

1. Bestimmung der optimalen Konzentration von Gemcitabin/Navitoclolax.
   1. Setzen Sie 10 Wildtyp-Zebrafischembryonen mit 48 hpf in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte ein.
   2. In jeder Vertiefung werden unterschiedliche Konzentrationen von Gemcitabin oder Navitoclolax zugegeben und zwei Tage lang bei 32 °C inkubiert.
   3. Berechnen Sie nach 2 Tagen die maximale Verträglichkeitsdosis (MTD) von Gemcitabin und Navitoclolax, bei der die Zebrafischlarven keine signifikanten Missbildungen und abnormales Verhalten zeigten, und die Arbeitskonzentrationen werden unter die MTD gesetzt.
2. Behandlung von zPDX-Modellen mit Gemcitabin/Navitoclolax.
   1. Setzen Sie 10 xenotransplantierte Larven in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte ein.
   2. Die Larven werden in vier Gruppen eingeteilt, die Kontrollgruppe in E3 mit 0,1 % DMSO behandelt, die anderen Gruppen mit 5 μg/ml Gemcitabin und/oder 50 μM Navitoclax behandelt und zwei Tage lang bei 32 °C inkubiert.
3. Bewertung der Zellviabilität und der zellulären Zusammensetzung in zPDX-Modellen.
   1. Betäuben Sie die xenotransplantierten Larven nach der Behandlung und legen Sie sie in 3% Methylcellulose.
   2. Betrachten Sie die Larven aus der Seitenansicht mit einem Fluoreszenzmikroskop oder Konfokalmikroskop.
   3. Quantifizieren Sie die Intensität von roten und grünen Fluoreszenzsignalen mit ImageJ und GraphPad-Software.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
L-Glutamin	GIBCO	21051024
Gemcitabin	Gemzan
Methylcellulose	Sigma	Nr. M0262
Navitoclax(ABT-263)	Selleck	Nr. S1001	Bcl-xL-Hemmer
Ausrüstung
Mikroinjektor	NARISHIGE
Konfokales Mikroskop	LEICA	SP8	0,00

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