Herzdissektion: Eine Methode zur Beobachtung der Herzentwicklung von Zebrafischen

Zusammenfassung

Quelle: Singleman C. et. al., Herzdissektion bei Larven, juvenilen und adulten Zebrafischen, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Isolierung des Herzens von einem Zebrafisch in mehreren Entwicklungsstadien, um die kardiale Entwicklung, Reifung und Alterung zu untersuchen.

Protokoll

1. Fische vermessen und sezieren

1. Legen Sie den einzelnen Fisch in die Petrischale, die zur Hälfte mit frischem PBS gefüllt ist, und legen Sie ihn auf die rechte Seite.
2. Messen Sie die Länge des Fisches von der Schnauze bis zum Schwanzansatz (dem Schwanzstiel), ohne Schwanzflossen, mit einem digitalen Messschieber (Abbildung 1). Dies ist die Standardlänge (SL).
3. Jedem Fisch kann eine Zahlen-Buchstaben-Kombination zugewiesen werden, so dass ein einzelner Fisch und das daraus resultierende präparierte Herz für eine spätere Analyse verfolgt werden können. Daten, einschließlich der Anzahl der elterlichen Lagerbestände, des Alters bei der Fixierung, der SL-Messungen, wurden in eine Tabelle eingegeben und auf der Grundlage dieser Beschriftungen organisiert.
4. Beschriften Sie die PCR-Röhrchenstreifen vor der Dissektion mit der zugewiesenen Sendungsverfolgungsnummer und füllen Sie sie mit PBT oder einer anderen Lösung, die für die weitere Analyse geeignet ist.
5. Richten Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in der Petrischale aus, während Sie den Körper mit einer Pinzette stabilisieren, die den Kopf zwischen Augen und Kiemen hält (Abbildung 1).

Kleinerer Fisch (kleiner als 12mm SL):

6. a) Mit einer scharfen Pinzette oder einer Mikronadel in einem Stecknadelhalter entfernst du die Brustmuskeln und Flossen aus dem Körper, um das Herz freizulegen. Durch die ständige Bewegung der Pinzette während der Dissektion können Strömungen im PBT entstehen, die den Fisch bewegen. Dies ist vor allem bei kleineren Fischen problematisch, daher kann mit einer Mikronadel Brustmuskulatur und Flossen entnommen und die Körperhöhle geöffnet werden.
7. a) Schöpfen Sie mit der Pinzette vorsichtig das Herz aus dem Hohlraum unter dem Vorhof. Bei einigen Fischen können Sie das Herz auch entfernen, indem Sie den Knollen vorsichtig herausziehen, und der Rest des Herzens wird folgen. Seien Sie vorsichtig mit der Position des Vorhofs, wenn Sie diese Technik anwenden, da er leicht beschädigt werden kann. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung und kann danach gereinigt werden.
8. a) Wenn der Fisch einen fluoreszierenden Herzmarker wie Tg(myl7:GFP)^twu34 enthält, verwenden Sie ein Fluoreszenzskop für die Dissektion und überprüfen Sie, ob das Herz durch Fluoreszenz entfernt wurde (Abbildung 2).
9. a) Sobald das Herz aus der Höhle entfernt wurde, verwenden Sie die Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um überschüssiges nicht-kardiales Gewebe und die Epikardauskleidung von der Außenseite des Herzens zu entfernen.

Größere Fische (größer als 12mm SL):

b) Machen Sie mit einer Mikroschere mit Federgriff drei Schnitte von weniger als 1 mm Tiefe: 1- Querschnitt durch die Kiemen 2- Querschnitt am vorderen Bauch 3- sagittaler Schnitt auf der ventralen Seite, der beide Schnitte verbindet (Abbildung 3).
1. b) Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette die Brustmuskeln und Flossen vom Körper, um die Körperhöhle zu öffnen und das silbrige Gewebe des Perikards freizulegen (Abbildung 4A). Entfernen Sie dieses Perikardgewebe und das Herz wird sichtbar (Abbildung 4B).
2. b) Schneiden Sie mit der Mikroschere die Arterie durch, die mit dem Arteriosus bulbus verbunden ist, der sich oberhalb des Herzens befindet. Sobald diese Arterie durchtrennt ist, legen Sie die Pinzettenspitzen unter den Vorhof und schöpfen Sie mit der Pinzette das Herz aus der Höhle. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung und kann später entfernt werden.
3. b) Sobald das Herz aus der Höhle entfernt wurde, verwenden Sie die beiden Zangen, um das Herz zu halten und überschüssiges Gewebe zu entfernen, oder eine Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um zusätzliches, nicht kardiales Gewebe zu entfernen. Die Epikardschleimhaut, erkennbar an ihrer schwarzen Pigmentierung, kann auf Wunsch durch sanftes Abkratzen des Gewebes von der Außenseite des Herzens entfernt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1.Halten Sie den Fisch mit einer Pinzette zwischen Augen und Kiemen.

Abbildung 2.Ein kardialspezifischer fluoreszierender transgener Marker wie Tg(myl7:GFP)^twu34, der hier gezeigt wird, kann bei der Visualisierung von Herzen helfen, die von kleineren Fischen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pinzette #55	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11295-51
Mikro-Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 15005-08
Anstecknadel-Halter	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 26016-12
Mikro-Nadeln	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 10130-10
Petrischalen	BD Biowissenschaften	351029