Zebrafisch-Hirndissektion: Eine Technik der Fisch-Neurobiologie

Zusammenfassung

Quelle: Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolierung und Kultur adulter Neurosphären aus dem Zebrafischgehirn. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt die Technik der Mikrodissektion des Gehirns eines erwachsenen Zebrafisches. Diese Methode hilft dabei, aus dem gesamten Gehirn gewonnene Neuorosphären zu erhalten, die weiter untersucht werden können.

Protokoll

1. Sektion des Gehirns eines adulten Zebrafisches

1. Bereiten Sie ein Präparierbett vor, indem Sie eine 100 mm x 15 mm große Petrischale mit Gel-Eisbeuteln füllen. Dann den Deckel auf die Petrischale legen und bei -20 °C inkubieren, bis das Gel gefriert. Legen Sie ein Quadrat sauberes Filterpapier auf den Deckel und wickeln Sie sowohl das Filterpapier als auch die Petrischale mit Plastikfolie ein.
2. Reinigen und sterilisieren Sie alle Mikrodissektionsinstrumente vor jedem Gebrauch mit 70 % Ethanol oder Hitze. Platzieren Sie alle sterilisierten Präparierinstrumente in der Nähe des Präpariermikroskops und stellen Sie das Präparierbett unmittelbar vor der Euthanasie unter das Mikroskop mit Lichtwellenleiterbeleuchtung.
3. Sammle 2 erwachsene Zebrafische für eine Neurosphärenvorbereitung des gesamten Gehirns und 3 bis 4 Zebrafische, um Neurosphären aus präparierten Hirnregionen zu erzeugen.
4. Euthanasieren Sie erwachsene Zebrafische (8-12 Monate alt) nach einem Protokoll, das vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde. Tauchen Sie den Fisch anschließend 5-10 Sekunden lang in 75%iges Ethanol und legen Sie ihn schnell in das Sezierbett, gefolgt von der Enthauptung auf Höhe der Kiemen mit einer chirurgischen Klinge.
   1. Um Tiere einzuschläfern, verabreichen Sie eine Überdosis (300 mg/l) Tricain-Methansulfonat, bis sich der Herzschlag des Tieres allmählich verlangsamt und die Durchblutung stoppt, und tauchen Sie sie dann in Eiswasser.
5. Drehen Sie den Kopf mit der Rückenseite nach unten und machen Sie mit der Schere einen Längsschnitt von der Schnittseite zum Mund. Mit der Pinzette legen Sie die Schädelbasis frei und entfernen das gesamte angrenzende Gewebe. Schneiden Sie die Seitenwände des Schädels vom Anfang des Rückenmarks in Richtung Tectum ab.
6. Schneiden und entfernen Sie mit der Schere die Sehnerven und entfernen Sie dann beide Seiten des seitlichsten Teils des Schädels auf Höhe des Tectums. Drehen Sie den Kopf mit der Bauchseite nach oben. Ziehe mit einer Pinzette den Rest des apikalsten Teils des Schädels ab.
7. Übertragen Sie das Gehirn zusammen mit dem restlichen Teil des Schädels in eine neue Schale mit dem Dissektionsmedium (DMEM/F12 mit Penicillin /Streptomycin). Reinigen Sie das Hirngewebe im Präpariermedium mit dem Kunststoffgriff des Mikromessers, wobei alle Gehirnstrukturen intakt bleiben.
8. Setzen Sie von diesem Punkt aus das Protokoll mit dem gesamten Zebrafischgehirn fort.
   1. Alternativ können Sie dieses Protokoll an bestimmte Gehirnregionen anpassen, um Neurosphären aus dem gesamten Zebrafischgehirn oder aus dem Telencephalon, dem Tectum/Diencephalon oder dem Kleinhirn zu erzeugen, die mit einem frischen Skalpell präpariert wurden. Verwenden Sie eine neuronalspezifische fluoreszierende transgene Linie für Zebrafische, um die interessierende Gehirnregion gemäß Abbildung 1 zu präparieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Differenzierung von Neurosphären aus dem Zebrafischgehirn.(A-C, E) Phasenkontrastbilder von Neurosphären aus dem gesamten Gehirn, die während 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) und 4 (C und D, DiVd4) Tagen im Z-Differenzierungsmedium kultiviert wurden. (E) Dorsale Ansicht des ges...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F12 1x	Lebenstechnologien	Tel.: 11330-032
Penicillin-Streptomycin	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122
Tricain MS-222	Sigma	Nr. A5040	Stammlösung von 4 mg/ml