Orthotope Injektion: Implantation gewebespezifischer Krebszellen in eine erwachsene Maus

Zusammenfassung

Quelle: Katsuta, E., et al. Erzeugung eines Maus-Orthotopen metastasierender Brustkrebsmodelle und Durchführung einer Mausradikalen Mastektomie.J. Vis. Exp.(2018).

Das Video demonstriert die orthotope Inokulationstechnik für Brustkrebs in einem Mausmodell. Diese Technik führt zu einer hohen Tumorgeneserate mit geringerer Variabilität in Tumorgröße und -form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgischen Injektion.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen (für 10 Mäuse)

HINWEIS: Die Zellen sollten innerhalb von 1 h nach dem Abnehmen von der Schale geimpft werden, um eine verminderte Zellviabilität zu vermeiden. Konkret sollte die Zellsuspension innerhalb von 15 Minuten nach dem Lösen der Zellen von der Schale in die gallertartige Proteinmischung gemischt werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

1. Kultivieren Sie 4T1-luc2-Zellen, eine Adenokarzinom-Zelllinie der Maus, die Luciferase exprimiert, in RPMI 1640-Medien mit 10 % FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO₂.
2. Waschen Sie die adhärenten 4T1-luc2-Zellen in einer 10-cm-Schale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer serologischen 10-ml-Pipette. 1 ml 0,25 % Trypsin mit einer P1000-Pipette zugeben und die Probe dann 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Geben Sie dann 4 ml Wachstumsmedium (RPMI-1640 mit 10 % FBS) mit einer serologischen 5-ml-Pipette hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen in einer Gewebekulturhaube. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 x g für 5 min.
3. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml PBS; dann zählen Sie die Zellen mit dem Hämozytometer.
4. 2 x 10⁶ 4T1-luc2-Zellen in 40 μl kaltem PBS (pH 7,4, 4 °C) in der Gewebekulturhaube suspendieren.
5. Mischen Sie die 40-μL-Zellsuspension mit 360 μL der gallertartigen Proteinmischung in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis in der Gewebekulturhaube.
   HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1 x 10⁵/20 μl (1:9 PBS:gallertartiges Proteingemisch). Für das orthotope Modell (keine Mastektomie) wurden 1 x 10⁴/20 μl der Endkonzentration verwendet, um das Erreichen der Euthanasiekriterien (Tumorgröße > 2 cm) innerhalb von zwei Wochen zu vermeiden.

2. Inokulation von Krebszellen

1. Legen Sie die Mäuse in die Anästhesie-Induktionskammer mit 2-4% Isofluran und 0,2 L/min Sauerstofffluss, bis die Mäuse ruhig atmen (2-3 min).
2. Fassen Sie die Maus und injizieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan in die Schulter.
3. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf ein Zehenklemmen. Führen Sie die Nase der Maus in das Loch der Mausmaske ein, was eine Inhalationsanästhesie mit 2-4% Isofluran und 2 L/min Sauerstofffluss ermöglicht, die an einer Aktivkohlekanistereinheit befestigt ist.
4. Fesseln Sie die Gliedmaßen der Maus mit Laborklebeband und sterilisieren Sie ihre Haut mit Wattestäbchen mit Chlorhexidin, Jod und 75 % Ethanol.
5. Machen Sie einen 5 mm großen Hautschnitt in der Mitte der vorderen Brustwand mit einer sterilen Mikrodissektionsschere, heben Sie die rechte Haut neben dem Schnitt an und lösen Sie die Haut mit der Schere von der Brustwand, und drehen Sie dann die Haut um, um das rechte #2 Brustfettpolster freizulegen.
6. Injizieren Sie vorsichtig 20 μl Krebszellsuspension mit einer 1 ml Insulinspritze und einer 28,5 g Nadel in das Fettpolster unter direkter Sicht durch die Wunde.
   HINWEIS: Die Nadel geht durch die Wunde, nicht durch die Haut. Halten Sie die Nadel 5 s lang im Fettpolster, bevor Sie sie herausziehen, damit sich die gallertartige Proteinmischung verfestigen kann.
7. Verschließen Sie die Hautschnitte durch Nähen mit sterilen, nicht resorbierbaren 5-0-Nähten.
8. Bringen Sie die Tiere nach der Operation in einen sauberen Käfig zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich erholt haben und sich frei bewegen (nach ~1–2 Minuten). Wenn ein Tier innerhalb von 24 Stunden nach der Operation nicht bei guter Gesundheit zu sein scheint, verabreichen Sie Buprenorphin (0,2 mg/kg).
9. Entfernen Sie die Nähte unter Narkose (siehe Schritt 2.1) 7 Tage nach der Operation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikro-Dissektionsschere	Roboz	RS-5983	Für die Innokulation von Krebszellen und Mastektomie
5-0 Seidennähte	schauen	774B F
Roswell Park Memorial Institute 1640	Gibco	11875093	Für die Zellkultur
Fötales Rinderserum	Gibco	10437028	Für die Zellkultur
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	Für die Zellkultur
Trockenes Sterilisationsmittel (Germinator 500)	Braintree Wissenschaftlich	GER 5287-120V	Für die Innokulation von Krebszellen und Mastektomie
Nadelhalter	Roboz	RS-7830	Für die Innokulation von Krebszellen und Mastektomie
Adson-Pinzette	Roboz	RS-5233	Für die Innokulation von Krebszellen und Mastektomie
Klipper	Wahl	Tel.: 9908-717	Für die Innokulation von Krebszellen und Mastektomie
Matrigel	Corning	354234	Für die Innokulation von Krebszellen