3D-Co-Kultur mit direkter Interaktion: Co-Kultivierung von Krebszellen mit Monozyten, um deren Interaktion zu untersuchen

Zusammenfassung

Quelle: Espinoza-Sánchez, et al. Analyse der Kommunikation zwischen Monozyten und primären Brustkrebszellen in einem extrazellulären Matrixextrakt (ECME)-basierten dreidimensionalen System. J. Vis. (2018).

Dieses Video beschreibt die 3D-Co-Kultur von Brustkrebszellen mit Monozyten, um ihre Interaktion in einer auf extrazellulären Matrixextrakt (ECME) basierenden Umgebung zu untersuchen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung spezifischer Merkmale wie Kollagenabbau, Rekrutierung von Immunzellen und Zellinvasion.

Protokoll

1. 3D Co-Kulturen mit direkter Interaktion

1. Markieren Sie BrC-Zellen und Monozyten vor der Zellkultur mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, um eine unabhängige Sortierung jeder Zelllinie nach der Kultur für die Analyse der mRNA- und Proteinexpression zu ermöglichen. Verwenden Sie kommerziell erhältliche Derivate von Cumarin und Rhodamin, die die Zellmembran lebender Zellen ungehindert passieren. Ein allgemeines Protokoll für die Beschriftung lautet wie folgt:
   1. Bereiten Sie eine Monoschicht von BrC-Zellen von Interesse vor (2 × 10⁶ Zellen in einem 25 cm 2-Kulturkolben) und ersetzen Sie das Standardmedium durch eine ausreichend vorgewärmte Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs (1:2.000 des Fluoreszenzfarbstoffs in Standard-Basismedium ohne Zusatz). 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO₂ inkubieren. Die Färbelösung ansaugen und vorsichtig mit ausreichend 1x PBS spülen. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie das Standardmedium hinzu.
   2. Trypsinisieren Sie die Zellmonoschicht mit 2 mL einer Lösung von 0,05 % Trypsin und 0,48 mM EDTA für 5-10 min bei 37 °C. Fügen Sie 200 μl FBS hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen, und 7 mL des entsprechenden Mediums ohne Zusätze. Resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μl, um Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen. Fahren Sie nach der Zellzählung mit dem Co-Kulturprotokoll fort.
   3. Pelletieren Sie die Zellen bei 430 x g für 5 min bei RT (führen Sie dies zuerst durch, da Monozyten in Suspension wachsen). Überstand verwerfen und die Zellen vorsichtig mit 3 ml einer vorgewärmten Arbeitslösung des Fluoreszenzfarbstoffs resuspendieren (1:2.000 des Fluoreszenzfarbstoffs in einem Standardbasismedium ohne Zusätze). 30 min bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO₂ inkubieren.
   4. Pelletieren Sie die Zellen erneut, verwerfen Sie die Farbstoffarbeitslösung und resuspendieren Sie sie vorsichtig mit 5-7 mL 1x PBS. Pelletieren Sie erneut, verwerfen Sie das PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 5-7 ml Standardmedium. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μl Zellsuspension, um Zellen in einer Neubauer-Kammer zu zählen. Fahren Sie nach der Zellzählung mit dem Co-Kulturprotokoll fort.
2. Stellen Sie die Co-Kultur wie folgt ein: Verteilen Sie genügend ECME auf dem Boden der Vertiefung, um in jeder Vertiefung eines 4-Well-Kammer-Gleitsystems eine gleichmäßige Schicht zu bilden. Platte: 20 μl einer Einzelzellsuspension, die 5 × 10⁵ markierte BrC-Zellen pro Vertiefung enthält.
3. Nach 15-20 min Inkubation bei 37 °C wird eine Suspension von 2,5 x 10⁵ markierten Monozyten in 80 μl Testmedium (ergänzt mit 60 % ECME) zugegeben.
4. Lassen Sie ECME 15-20 min bei 37 °C erstarren.
5. Fügen Sie 1 ml einer 1:1-Mischung aus den BrC-Zellen und Monozyten-Kulturmedien hinzu.
6. Inkubieren Sie Co-Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO₂ für 24 Stunden, 48 Stunden oder 5 Tage, um Veränderungen zu verschiedenen Zeitpunkten zu verfolgen.
7. Abbau von EZM-Proteinen, um die Zellen aus den Kulturen zurückzugewinnen. Das Medium aspirieren und verwerfen, 0,5 ml 1x PBS mit 0,1 % Trypsin und 0,25 % EDTA hinzufügen und 3 h bei 37 °C inkubieren. Fügen Sie nach der Inkubation 0,5 ml 1x PBS mit 10 % FBS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
8. Pelletzellen bei 765 x g für 5 min bei RT, den Überstand verwerfen und die Zellen in 5 mL von 1x PBS mit 10% FBS resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
9. Unterziehen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Gerät einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS). Stellen Sie sicher, dass die Endpopulationen zu mindestens 95 % rein sind.
10. Nach dem Sortieren die Zellen mit sterilem 1x PBS, Pellet (430 x g für 5 min bei RT) waschen und in sterilem 1x PBS resuspendieren. Zellen können nach spezifischen Protokollen für die RNA-Isolierung oder Proteinanalyse aufbereitet werden.
11. Wiederholen Sie jeden Assay dreimal, einschließlich 3D-Kulturen jeder einzelnen Zelllinie als Kontrollen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
U937	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1593.2	Monozytäre Zelllinie/histiozytäres Lymphom
THP-1	American Type Culture Collection ATCC	TIB-202	Monozytäre Zelllinie/akute monozytäre Leukämie
MCF-10A	American Type Culture Collection ATCC	CRL-10317	Nicht transformierte Brustzelllinie
MCF-7	American Type Culture Collection ATCC	HTB-22	Brustkrebs-Zelllinie
MDA-MB-231	American Type Culture Collection ATCC	HTB-26	Brustkrebs-Zelllinie
RPMI 1640 mittel	GIBCO BRL Life Technologies	Artikel-Nr.: 11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	Artikel-Nr.: 11039-021
Antibiotikum/Antimykotikum	GIBCO BRL Life Technologies	Artikel-Nr.: 15240-062	100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Fungizone
Fötales Rinderserum	GIBCO BRL Life Technologies	Artikel-Nr.: 16000-044
Pferde-Serum	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0,05 % Trypsin-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	Artikel-Nr.: 25300-062
PBS 1X (phosphatgepufferte Kochsalzlösung	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1,00 mg)
Insulin	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hydrocortison	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Choleratoxin Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	Nr. C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom, extrazellulärer Matrixextrakt, Lagerung bei -20°C bis zur Verwendung bei 4°C
Lab-Tek Kammerobjektträger mit Abdeckung (8 Vertiefungen)	Nalge Nunc International	177402