zPDX-Analyse der Invasivität: Untersuchung des invasiven Verhaltens von metastasierten Krebszellen in Zebrafischembryonen Xenotransplantaten

Zusammenfassung

Quelle: Ren, J. et al. invasives Verhalten menschlicher Brustkrebszellen im embryonalen Zebrafisch. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung von Brustkrebszellen in den perivitellinischen Raum von transgenen Zebrafischembryonen. Nach der Inkubation visualisieren wir den Embryo unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Invasion, Verbreitung und Metastasierung von Krebszellen zu beobachten.

Protokoll

>1. Den Metastasierungsprozess abbilden und analysieren

1. Entnehmen Sie mehrere betäubte Embryonen mit einer Pasteur-Pipette mit breiter Spitze und übertragen Sie sie auf den Glasboden einer Styroporschale.
2. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und bewahren Sie eine begrenzte Menge Eiwasser auf. Manipulieren Sie den Embryo mit einem Haarschlaufenwerkzeug in Position und legen Sie eine Abdeckung auf das Glas.
3. Verwenden Sie ein inverses konfokales Mikroskop in Kombination mit Wasserimmersions- oder Trockenobjektiven mit großer Entfernung. Positionieren Sie den Embryo so, dass der interessierende Bereich so nah wie möglich am Ziel liegt.
4. Führen Sie unmittelbar nach der Anästhesie eine Bildgebung durch, um das Risiko eines Todes durch Flüssigkeitsverdunstung zu verringern.
   1. Erfassen Sie Signale von EGFP-markierten Gefäß- und mCherry-markierten Tumorzellen an der gleichen Position auf den Embryonen, um injizierte Zellen mit Blutgefäßen durch Zusammenführen der beiden Bildgebungskanäle zu registrieren.
   2. Sammeln Sie für jeden Zebrafischembryo zwei verschiedene Bildsätze aus der Kopf- und Schwanzregion.
5. Quantifizieren Sie die Anzahl der disseminierten Zellen.
   1. Bei Injektionen in den perivitellinen Raum ist die Anzahl der Zellen in jedem Fisch zu zählen, die sich aus der Zellmasse in Richtung des embryonalen Fischkörpers in der Kopf- und Schwanzregion ausgebreitet haben 4,15; die Regionen befinden sich jenseits der Grenzen der Herzhöhle frontal, oberhalb der Schwimmblase dorsal und jenseits der Urogenitalöffnung kaudal.
   2. Zählen Sie für die Doc-Injektion die Anzahl der einzelnen Zellen, die aus dem Blutkreislauf in die Kollagenfasern der Schwanzflosse eingedrungen sind (MDA-MB-231) oder die Anzahl der Cluster, die von Zellen gemeinsam (M2) im kaudalen hämatopoetischen Gewebe (CHT) jedes Zebrafisches gebildet wurden19.
6. Untersuchen Sie Invasion und Metastasierung mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (sehr empfohlen).
   1. Verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (4-faches Objektiv), um den gesamten Körper abzubilden und einen Überblick über das Verbreitungsmuster der Tumorzellen zu erhalten.
      HINWEIS: Eine höhere Vergrößerung (20-fache und 40-fache Objektive) eignet sich für die Untersuchung der intra- und peritumoralen Angiogenese und die genaue Lokalisierung von disseminierten Zellen im Embryokörper.
   2. Verwenden Sie einen 488-nm-Laser, um das Gefäßsystem des Zebrafischembryos zu scannen, und einen 543-nm-Laser, um implantierte Tumorzellen zu scannen, die mit roter Fluoreszenz markiert sind. Erhalten Sie ein qualitativ hochwertiges Bild, indem Sie jeden Embryo in acht bis zehn Schritten scannen. Scannen und mitteln Sie jeden Schritt sechsmal.
7. Setzen Sie den Embryo vorsichtig wieder in das Eiwasser ein, wenn er für weitere Experimente benötigt wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pasteur-Pipette mit breiter Spitze (0,5-20 μl)	Eppendorf	F276456I
Konfokales Mikroskop	Leica	SP5 STED
Stereomikroskop	Leica	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) Zebrafisch-Stamm			Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ewa SnaarJagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, Niederlande)
Styroporschale mit Glasboden	WillCo	GWST-5040
Fluoreszierendes Stereomikroskop	Leica	M165 FC
Tricain (3-Aminobenzoesäure)	SigmaAldrich	Nr. A-5040