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1. Dezellularisierung
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von zuvor veröffentlichten Methoden angepasst, die sich auf die Fettdezellularisierung konzentrierten, die das ionische Natriumdesoxycholat-Detergens anstelle von Natriumdodecylsulfat enthielten, um DNA effizient zu entfernen.
- Entfernen Sie an Tag 1 gefrorene Brustfettpolster oder MFPs bei -80 °C und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf.
- Trocknen Sie MFPs nach dem Auftauen kurz mit einem zarten Tuch. Wiegen Sie die MFPs mit einer Analysewaage
.
- Teilen Sie das Gewebe mit einer Pinzette mit einer Schere oder einem Skalpell in 3 mm x 3 mm große Proben für die Untersuchung der intakten EZM und das verbleibende Gewebe für die Hydrogelproduktion
Anmerkung: Die Anzahl der Proben ist abhängig von der Anzahl der Prüfmethoden, z.B. wird im Folgenden die Entnahme von zwei Proben beschrieben: eine für die Paraffineinbettung (Schritt 1.5) und eine für das Einfrieren in Kryostat-Einbettmedium, falls gewünscht (siehe Werkstofftabelle und Schritt 1.6).
- Wiegen Sie das Taschentuch. Wenn Sie zum Trennen in Paraffin einbetten, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. Beim Einfrieren in Kryostat-Einbettungsmedium für das Schneiden fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
- Tauchen Sie das Gewebe in einer chemischen Haube für 24 Stunden bei 4 °C in 10 % neutrales gepuffertes Formalin (NBF) (siehe Materialtabelle). Waschen Sie es 3 Mal für jeweils 5 Minuten in PBS. Tauchen Sie das Gewebe 48 h lang bei 4 °C in 30%ige Saccharose.
- Wiegen Sie das Taschentuch, nachdem dieses Stück entfernt wurde. Fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
- Legen Sie die MFP-Teile in eine beschriftete Kassette, die mit Kryostat-Einbettungsmedium vorbereitet ist. Fügen Sie mehr Kryostat-Einbettungsmedium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
- Die Kassette wird in ein Becherglas mit 2-Methylbutan (siehe Materialtabelle) gelegt, das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist. Das Becherglas sollte genügend 2-Methylbutan enthalten, um den Boden zu bedecken, aber nicht genug, um die Kassette zu untertauchen, da das Kryostat-Einbettungsmedium das 2-Methylbutan nicht berühren sollte. Lassen Sie die Kassette im 2-Methylbutan sitzen, bis das Kryostat-Einbettmedium gefriert und undurchsichtig wird.
- Wickeln Sie die Kassette(n) in Folie ein, beschriften Sie sie und lassen Sie sie bei -80 °C, bis sie zum Trennen verwendet werden.
Anmerkung: Gewebe, die unmittelbar in das Kryostat-Einbettungsmedium gelegt wurden, wurden bei 5 μm geschnitten, während Gewebe, die in Saccharose inkubiert wurden, bei 30 μm geschnitten wurden, um die Adipozytenmorphologie zu erhalten.
- Massieren Sie das restliche Gewebe mit einer Pinzette manuell.
Anmerkung: Gewebestücke können auch 24–48 Stunden lang in 10 % NBF gelegt, in PBS gespült und bis zur Einbettung in Paraffin in 70 % Ethanol belassen werden. Nach der Einbettung können 5-μm-Schnitte für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E) verwendet werden (siehe Abschnitt 2 unten).
- Legen Sie die MFPs in 6-cm-Schalen mit 5 ml 0,02 % Trypsin/0,05 % EDTA-Lösung. Bei 37 °C 1 h inkubieren. Besprühen und wischen Sie die Schalen mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie in den Inkubator stellen.
- Verwenden Sie 0,7-mm-Siebe, um die MFPs mit entionisiertem (DI) Wasser zu waschen, indem Sie das Gewebe dreimal mit Wasser übergießen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zwischen den Wäschen manuell zu massieren.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es. Legen Sie die Taschentücher in ein vorautoklaviertes Becherglas, das einen Rührstab in geeigneter Größe enthält. Decken Sie das Gewebe mit 60 ml 3 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Materialtabelle) pro 1 g Gewebe ab und rühren Sie es 1 h lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
- Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser ab und gießen Sie ihn auf ein Taschentuch. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es. Legen Sie die Taschentücher und Rührstäbchen wieder in dieselben Becher und bedecken Sie sie mit 60 ml 4%iger Desoxycholsäure pro 1 g Gewebe. 1 h bei Raumtemperatur rühren. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
- Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser ab und gießen Sie ihn auf ein Taschentuch. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es.
- Legen Sie das Taschentuch in dasselbe Becherglas mit frischem DI-Wasser, das mit 1 % Penicillin-Streptomycin versetzt ist. Fest mit Paraffinfolie abdecken. Über Nacht bei 4 °C ziehen lassen.
- Waschen Sie Siebe und Becher für den Gebrauch am nächsten Tag.
- Lassen Sie den Becherinhalt an Tag 2 in ein Sieb abtropfen. Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es.
- Setzen Sie die MFPs mit einem Rührstab in geeigneter Größe in denselben Becher ein. Mit 60 ml 4%iger Ethanol/0,1%iger Peressigsäurelösung pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 2 h bei Raumtemperatur umrühren.
- Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-mm-Sieb. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe manuell zu massieren. Den Inhalt wieder in das Becherglas geben. Waschen Sie das Tuch, indem Sie es mit 60 ml 1x PBS pro 1 g Tuch bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur rühren. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
- Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-mm-Sieb. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe manuell zu massieren. Den Inhalt wieder in den Becher geben. Waschen Sie das Tuch, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Tuch bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur rühren. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es. Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe manuell zu massieren.
- Den Inhalt wieder in den Becher geben. Decken Sie das Gewebe mit 60 ml 100 % n-Propanol pro 1 g Gewebe ab. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 1 h bei Raumtemperatur rühren.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es. Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-mm-Sieb. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe manuell zu massieren.
- Den Inhalt wieder in den Becher geben. Waschen Sie das Tuch, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Tuch bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur rühren. Wiederholen Sie dies dreimal.
- Schütten Sie das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis 2.6, um Gewebestücke für die Saccharose-Inkubation und das Einfrieren in Kryostat-Einbettungsmedium zu sammeln.
- Trocknen Sie das Tuch kurz auf einer empfindlichen Aufgabe, wischen Sie es ab und wiegen Sie es. In ein beschriftetes 15-ml-Röhrchen geben. Über Nacht bei -80 °C einfrieren.