Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Behandlung mit Bleomycin
- Planen Sie, Mäusen 14 Tage vor der Tumorzelltransplantation intratracheal Bleomycin zu injizieren.
- Tauen Sie die Bleomycin-Brühe 2 h vor der Injektion auf Eis auf.
- Nach dem Auftauen Bleomycin auf die gewünschte Arbeitskonzentration (0,02 U/50 μl oder 0,005 U/50 μl) verdünnen und auf Eis legen.
Anmerkung: Die Konzentration von Bleomycin hängt von dem für die Experimente verwendeten Mausstamm ab (Tabelle 1). Die Titration von Bleomycin bei Mäusen sollte durchgeführt werden, um die optimale Dosis zu bestimmen.
- Bereiten Sie die Anästhesie vor, indem Sie Ketamin und Xylazin auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml bzw. 1 mg/ml verdünnen. Betäuben Sie jede Maus mit einer 1 ml-Spritze und einer 27-g-Nadel durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin-Lösung in einer Menge von 100/10 mg/kg.
- Überwachen Sie die Atmung von Mäusen und setzen Sie eine Zehenkneifung ein. Vergewissern Sie sich auf die richtige Betäubung, wenn die Maus nicht auf das Einklemmen der Zehen reagiert. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
- Platzieren Sie jeweils 1 Maus auf einer Intubationsplattform, indem Sie die Vorderzähne mit dem Rücken gegen die Plattform hängen.
- Beleuchten Sie die obere Brust mit einem faseroptischen Strahler, um die Luftröhre sichtbar zu machen. Öffnen Sie den Mund der Maus und ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer sterilen Flachzange heraus.
- Verwenden Sie einen intravenösen Katheter ohne Nadel, um eine Blockade der Atmung zu vermeiden. Positionieren Sie den Katheter über dem weißen Licht, das aus der Öffnung der Luftröhre ausgestrahlt wird.
- Führen Sie den Katheter in die Luftröhre ein, bis die Oberseite des Katheters die Frontzähne erreicht. Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre, indem Sie das weiße Licht visualisieren, das durch die Öffnung des Katheters im Mund scheint.
- Geben Sie mit einer Pipette 50 μl Bleomycin oder Vehikel (PBS) direkt in den Katheter, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen inhaliert wird. Führen Sie diesen Schritt unter sterilen Bedingungen durch.
- Wenn der Katheter richtig eingeführt ist, inhaliert die Maus sofort den Inhalt des Katheters. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volumen den Katheter hinunter wandert. Entfernen Sie dann den Katheter aus der Luftröhre und entsorgen Sie ihn in 10%iger Bleichlösung.
Anmerkung: Die durchschnittliche Zeit pro Maus für die Schritte 1.7-1.11 beträgt etwa 5 Minuten.
- Wenn die Maus die Flüssigkeit nicht einatmet, überwachen Sie die Atmung sorgfältig und passen Sie die Katheterposition an. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie sofort den Katheter und lassen Sie die Maus normal wieder atmen, bevor Sie den Katheter wieder einführen.
- Legen Sie die injizierte Maus zur Wiederherstellung auf ein von der IACUC zugelassenes Heizkissen auf dem Rücken auf eine ebene Fläche. Der gesamte Vorgang dauert 10 Minuten pro Maus. Geben Sie ein Tier, das einer Injektion unterzogen wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es vollständig genesen ist.
- Legen Sie eine Karte mit der Aufschrift "Gefährliche Chemikalie in Gebrauch" für 24 Stunden auf den Käfig.
>2. Transplantation von Lungen-Adenokarzinom-Zelllinien
HINWEIS: Führen Sie die Transplantation von Zellen 14 Tage nach der Injektion von Bleomycin durch (Schritt 1.1)
- Lassen Sie die Zellen in 75 cmgroßen 2 Kolben 3 Tage vor dem Tag der Injektion ungestört wachsen, wobei die entsprechenden Medien gemäß Schritt 1.3.
Anmerkung: Sie sollten am Tag der Injektion zu 80 % konfluent sein (was je nach Zelllinie 2-3 x 106 in jedem Kolben entspricht).
- Waschen Sie die auf75 cm großen 2 Kolben wachsenden Zellen mit 5 mL PBS bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie PBS und fügen Sie den Zellen 1,5 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sich die Zellen ablösen (typischerweise 2-5 Minuten).
Anmerkung: Wir empfehlen, alle 2 Minuten durch einfache Visualisierung des Kolbenbodens oder unter einem Lichtmikroskop auf Zellablösung vom Kunststoff zu überprüfen. Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Inkubation mit Trypsin.
- Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml Medium mit 10 % FBS hinzufügen (dasselbe Medium wie in Schritt 2.1). Sammeln Sie die Zellen in ein 15 mL Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 mL PBS, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur zu Pelletzellen. Wiederholen Sie dies 1 Mal.
- Das PBS wird aspiriert und das Pellet in 1,5 ml PBS pro Kolben resuspendiert.
- Mischen Sie 50 μl Zellmischung mit 50 μl Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einer Zellzähler-/Hämozytometerkammer.
- Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie die Zellen in PBS verdünnen, um 1 x 105 Zellen (oder eine andere angegebene Menge) in 50 μl pro Maus zu injizieren. Halten Sie die Zellen vor der Injektion auf Eis.
Anmerkung: Bereiten Sie mindestens zweimal mehr Zellen für die Injektion vor, um zu vermeiden, dass Ihnen die Zellsuspension ausgeht.
- Bereiten Sie die Anästhesie vor, indem Sie Ketamin und Xylazin auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml bzw. 1 mg/ml verdünnen. Betäuben Sie jede Maus mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-g-Nadel durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin-Lösung in einer Menge von 100/10 mg/kg.
- Überwachen Sie die Atmung von Mäusen und setzen Sie eine Zehenkneifung ein. Vergewissern Sie sich auf die richtige Betäubung, wenn die Maus nicht auf das Einklemmen der Zehen reagiert. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
- Platzieren Sie jeweils 1 Maus auf einer Intubationsplattform, indem Sie die Vorderzähne mit dem Rücken gegen die Plattform hängen.
- Beleuchten Sie die obere Brust mit einem faseroptischen Strahler, um die Luftröhre sichtbar zu machen.
- Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einer p200-Pipette, um sicherzustellen, dass sie keine Klumpen bilden. Öffnen Sie den Mund der Maus und ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit einer sterilen Flachzange heraus.
- Verwenden Sie einen intravenösen Katheter mit entfernter Nadel, um eine Blockade der Atmung zu vermeiden. Positionieren Sie den Katheter über dem weißen Licht, das aus der Öffnung der Luftröhre ausgestrahlt wird.
- Führen Sie den Katheter in die Luftröhre ein, bis die Oberseite des Katheters die Frontzähne erreicht. Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre, indem Sie das weiße Licht visualisieren, das durch die Öffnung des Katheters im Mund scheint.
- Geben Sie mit einer Pipette 50 μl Zellen direkt in den Katheter, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen inhaliert wird. Führen Sie diesen Schritt unter sterilen Bedingungen durch.
Anmerkung: Wenn der Katheter richtig eingeführt ist, inhaliert die Maus sofort den Inhalt des Katheters.
- Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volumen den Katheter hinunterwandert ist, entfernen Sie dann den Katheter aus der Luftröhre und entsorgen Sie ihn in 10% iger Bleichlösung.
- Wenn die Maus die Flüssigkeit nicht einatmet, überwachen Sie die Atmung sorgfältig und passen Sie die Katheterposition an. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie sofort den Katheter und lassen Sie die Maus normal wieder atmen, bevor Sie den Katheter wieder einführen.
Anmerkung: Die durchschnittliche Zeit pro Maus der Schritte 2.11-2.18 beträgt etwa 5 Minuten.
- Legen Sie die injizierte Maus zur Wiederherstellung auf ein von der IACUC zugelassenes Heizkissen auf dem Rücken auf eine ebene Fläche.
Anmerkung: Der gesamte Vorgang dauert 10 Minuten pro Maus. Geben Sie ein Tier, das einer Injektion unterzogen wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es vollständig genesen ist.
- Rasieren Sie den gesamten Rippenbereich sowohl ventral als auch dorsal von B6129SF1/J und anderen Mausstämmen mit dunklem Haar mit einem Elektrorasierer vor der Bildgebung.
- 2-3 Minuten nach der Zellinjektion 100 μl Luciferin retroorbital (15 mg/ml) mit einer Insulinnadel injizieren. Wechseln Sie das Auge, das für die Injektion verwendet wird, bei jeder Bildgebungssitzung ab.
- Platzieren Sie nach mindestens 2 Minuten bis zu 5 Mäuse in einem tierischen Biolumineszenz-Imager in der dorsalen Liegeposition und nehmen Sie ein ventrales Bild mit den Lumineszenzeinstellungen auf.
- Passen Sie in der Systemsteuerung die Auflösungs- und Empfindlichkeitseinstellungen an, um die Lumineszenz einer bestimmten Zelllinie zu messen. Beginnen Sie für die meisten Anwendungen mit 3 min (oder "Auto", wenn gesättigt), Binning = Mittel (4), Blende = 1, Sichtfeld = D, Motivhöhe = 1.50.
Anmerkung: Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird ein Lumineszenzsignal im oberen Brustbereich, in einer Lunge oder in beiden Lungen nachgewiesen.
- Drehen Sie die Mäuse in die sternale Liegeposition und nehmen Sie ein dorsales Bild wie oben auf.
Anmerkung: Wenn die Zellinjektion nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, können sich die Zellen am Eingang der Luftröhre oder im Hals ansammeln.
- Injizieren Sie Ketoprofen 5 mg/kg intraperitoneal, um Schmerzen zu lindern.
- Bringen Sie die Mäuse zurück in ihren Käfig und legen Sie eine Karte mit der Aufschrift "BSL-2 Agent in Gebrauch" auf den Käfig.
- Überwachen Sie die Mäuse unmittelbar nach der Intubation auf Atemnot und dann alle 15 Minuten, bis die Mäuse aus der Narkose aufwachen. Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten.
- Untersuchen Sie die Mäuse 24 Stunden nach der Intubation und dreimal pro Woche auf Anzeichen von Morbidität.
- Notieren Sie im Logbuch das Datum des Eingriffs, die Identifizierung der Tiere, die Art des Eingriffs, die Art der Anästhesie und die Beobachtungen und Zeiten der postoperativen Überwachung.
- Überwachen Sie Mäuse alle zwei Wochen nach der Inokulation von Bleomycin auf Gewichtsverlust, Atemnot, Verhaltensauffälligkeiten und einen Body Condition Score <2 (Segmentierung der Wirbelsäule offensichtlich/dorsale Beckenknochen sind tastbar><).
Anmerkung: Mäuse mit Lungentumoren können Atemwegsreizungen, Gewichtsverlust, Kachexie und/oder Tod aufweisen.
- Euthanasieren Sie Mäuse unter Atemnot oder Mäuse, die einen Verlust von 15 % an Körpermasse durch Kohlendioxid oder Ketamin/Xylazin erlitten haben, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation, wenn Gewebe entnommen wird. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie eine Palpation auf Atemtätigkeit durchführen.
>3. Überwachung des Tumorwachstums durch Biolumineszenz-Bildgebung
- Wiederholen Sie die Bildgebung der Mäuse am Tag 3 nach der Transplantation und danach wöchentlich.
- Betäuben Sie Mäuse durch Injektion von Ketamin/Xylazin (wie in den Schritten 2.4-2.5 beschrieben) oder durch inhalatives Isofluran (2%). Überwachen Sie die Atmung von Mäusen und setzen Sie eine Zehenkneifung ein, um die richtige Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern.
- Rasieren Sie vor der Bildgebung den gesamten Rippenbereich sowohl ventral als auch dorsal von B6129SF1/J und anderen Mausstämmen mit dunklem Haar mit einem Elektrorasierer.
- Sobald die Mäuse unter Narkose stehen, injizieren Sie 100 μl Luciferin retroorbital (15 mg/ml) mit einer Insulinnadel. Warten Sie 2 Minuten. Wechseln Sie das Auge, das für die Injektion verwendet wird, bei jeder Bildgebungssitzung ab.
- Platzieren Sie die Mäuse in den Imager und nehmen Sie dorsale und ventrale Bilder auf, wie in den Schritten 2.22-2.24 beschrieben.
- Setzen Sie die Mäuse nach der Bildgebung zurück in den Käfig, auf dem Rücken auf einer ebenen Fläche, um sich zu erholen.
Anmerkung: Die gesamte Prozedur dauert 5 Minuten pro Gruppe von 5 Mäusen. Lassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten.
- Analysieren Sie die Bilder mit der Imager-/Biolumineszenz-Analysesoftware.
