Dosis-Eskalation: Eine Methode zur Entwicklung von Arzneimittelresistenzen in Krebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Yamaoka T. et al., Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom-PC-9-Zelllinien, die mit steigenden Dosen von Afatinib entwickelt wurden. J. Vis. Exp., 2019

Das Video beschreibt die Entwicklung von Arzneimittelresistenz in Krebszellen, indem Zellen eskalierenden Dosen eines Medikaments ausgesetzt werden, nachdem die IC_50-Werte des Medikaments zuvor mit dem MTT-Assay berechnet wurden. Das Probenprotokoll beschreibt den schrittweisen Prozess der Entwicklung arzneimittelresistenter Zellen.

Protokoll

1. Etablierung von drei unabhängigen Afatinib-resistenten PC-9-Zelllinien

1. Bestimmung der anfänglichen Afatinib-Expositionskonzentration für PC-9-Zellen mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay.
   1. Kultivieren Sie PC-9-Zellen in einem Wachstumsmedium, das fötales Rinderserum (10 %), Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) enthält, in einer mit Zellkulturen behandelten 10-cm-Schale in einem 5 %_{CO 2} -Inkubator bei 37 °C.
   2. Resuspendieren Sie PC-9-Zellen bei 4 x 10⁴ Zellen/ml in Wachstumsmedium und säen Sie sie dann bei 50 μl/Well in einer 96-Well-Mikroplatte. Die Endkonzentration der Zellen beträgt 2,0 x 10³ Zellen/50 μL/Well. Über Nacht in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C inkubieren.
   3. Geben Sie 50 μl Afatinib-Lösung in verschiedenen Konzentrationen: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 und 20 μM in die Vertiefungen, die das Wachstumsmedium (50 μl) enthalten. Das endgültige Volumen und die Konzentrationen von Afatinib betragen 100 μl bzw. 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 bzw. 10 μM.
   4. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 96 Stunden lang in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
   5. Geben Sie 15 μl der Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 4 Stunden lang in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C, geben Sie dann 100 μl Solubilisierungs-/Stopplösung (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und inkubieren Sie über Nacht in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C.
   6. Messen Sie die optische Dichte bei 570 nm (OD₅₇₀) mit einem Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 6-12 Wiederholungen vor und wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal.
   7. Verwenden Sie eine Statistiksoftware (siehe Materialtabelle), um diese Daten grafisch als Semi-Log-Diagramm darzustellen und den IC_50-Wert zu berechnen, d. h. die Wirkstoffkonzentration, die das Ansprechen auf 50 % ihres Maximums reduziert (siehe Materialtabelle).
2. Kontinuierliche Exposition von PC-9-Zellen gegenüber dem irreversiblen EGFR-TKI, Afatinib, durch schrittweise Dosissteigerung in drei unabhängigen 10-cm-Schüsseln
   1. Kultivieren Sie PC-9-Zellen in p100-Schalen, die 10 ml Wachstumsmedium enthalten. Wenn die PC-9-Zellen das subkonfluente Stadium erreichen, überführen Sie 1 ml Zellsuspension in drei neue p100-Schalen mit 9 ml Wachstumsmedium. Die 1:10 verdünnten PC-9-Zellen werden innerhalb von 3-4 Tagen subkonfluent, mit einer Zellzahl von etwa 4-5 x 10⁵ Zellen/ml.
   2. Geben Sie am nächsten Tag 1/10 des IC_50-Wertes von Afatinib in jede der drei p100-Schale.
      HINWEIS: Afatinib wird in DMSO in Stammkonzentrationen von 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM und 5 mM rekonstituiert. 1 bis 10 μl Afatinib-Lösung werden in 10 ml Wachstumsmedium in der Kultur gemäß den erforderlichen Endkonzentrationen zugegeben.
   3. Wenn die Zellen in den Afatinib-haltigen p100-Schalen subkonfluent werden, mischen Sie sie gut durch Aspiration mit einer 1-ml-Pipette und fügen Sie 1 ml der Zellsuspension zu 9 ml frischem Wachstumsmedium in einer neuen p100-Schale hinzu. Als nächstes fügen Sie der neuen Kultur 10-20% höhere Konzentrationen von Afatinib hinzu.
   4. Erhöhen Sie die Afatinib-Konzentration von 0,1 nM bis 1 μM im Medium durch die schrittweise Dosissteigerung, wobei die Afatinib-Konzentration bei jedem Schritt über einen Zeitraum von 10-12 Monaten um 10-20% erhöht wird.
      Anmerkung: Wenn sich die Afatinib-Konzentration dem_IC-50-Wert nähert, wird das Zellwachstum ziemlich langsam. Wenn die Zellen 1:9 gespalten werden, wachsen sie möglicherweise nicht, da diese Zellen durch höhere Konzentrationen von Afatinib abgetötet werden. Daher können die Zellen bei höheren Afanitib-Konzentrationen im Verhältnis 1:2 gespalten werden. Die resistentesten Zellen wurden 3-14 Tage lang in einem in Afatinib enthaltenen Medium gezüchtet, und das Medium wurde erst gewechselt, wenn die resistenten Zellen durchgelassen werden mussten.
   5. Kultivieren Sie die Afatinib-resistenten Zellen für 2-3 Monate in 1 μM Afatinib-haltigem Wachstumsmedium. Bei einer Afatinib-Konzentration von 1 μM sind in diesem Modell 10-12 Monate erforderlich, um eine Resistenz gegen Afatinib zu entwickeln. Führen Sie den MTT-Assay durch, um zu bestätigen, dass die Zellen gegen Afatinib resistent sind. Die drei unabhängig voneinander etablierten Afatinib-Resistenzzelllinien wurden als AFR1, AFR2 und AFR3 bezeichnet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FBS	Gibco	Tel.: 26140-079
Pen Strep	Gibco	Nr. 15140-163
Zellkulturbehandelte 10 cm Schale	Violamo	Tel.: 2-8590-03
Afatinib	Selleck	Nr. S1011
96-Well-Mikroplatte	Thermo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	Proliferationsassay für nicht-radioaktive Zellen; Färbelösung und Solubilisierungs-/Stopplösung
NanoDrop Lite Spektralphotometer	Thermo	Na	Spektralphotometer
GraphPad Prism v.7 Software	GraphPad, Inc.	Na	eine Statistiksoftware
Dmso	Wako	Tel.: 043-07216