Präparation von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben: Ein Protokoll zur Konservierung von Gewebe- und Zytologieproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)

Abstract

Quelle: Ilié, M., et al. Verwendung von 22C3 Anti-PD-L1-Antikörperkonzentrat auf Biopsie- und Zytologieproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben, die zur Konservierung von Gewebe- und Zytologieproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) verwendet werden

Protocol

1. Vorbereitung von Tumorgewebeproben

1. Fixieren Sie Tumorgewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin (NBF) in einer Kassette.
   Anmerkung: Tumorgewebe aus proximalen Lungentumoren wird in der Regel durch Bronchoskopie gewonnen, die unter mäßiger Sedierung von einem Pneumologen oder Lungenspezialisten durchgeführt wird. Bei peripheren Läsionen und diffusen Lungenerkrankungen ist eine transbronchiale oder Nadelbiopsie indiziert. Diese Eingriffe werden in der Regel in einem Operationssaal oder auf der Intensivstation durchgeführt.
2. Betten Sie die Kassette in Paraffin ein.
   Anmerkung: Die Fixierung kann durch Perfusion oder Eintauchen unmittelbar nach der Dissektion erreicht werden und dauert in der Regel 8–10 Stunden. Das Fixiervolumen sollte 15–20x höher sein als das Probenvolumen. Es wird nicht empfohlen, das Biopsiegewebe länger als 10 h zu fixieren, da eine Überfixierung zu einer Maskierung des Antigens führen kann. Die Fixiergeschwindigkeit beträgt bei Raumtemperatur ca. 1 mm/h.
3. Infiltrieren Sie die fixierte Gewebeprobe mit Wachs im Tissue-Prozessor (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Die Dehydrierung wird in drei Alkoholbädern mit steigenden Konzentrationen von 70%, 85% und 90% durchgeführt. Das Wasser wird schließlich durch drei abschließende absolute Alkoholbäder entfernt. Die Reinigung erfolgt in drei Toluolbädern, die Wachsinfiltration in heißen Wachsbädern (44–60 °C).
4. Betten Sie das Gewebe in eine mit geschmolzenem Paraffin gefüllte Form ein (siehe Materialtabelle) und warten Sie auf die Erstarrung.
5. Das in Paraffin eingebettete Gewebe wird in einer Dicke von 3 μm auf einem Mikrotom geschnitten.
6. Übertragen Sie das Paraffinband auf einen positiv geladenen Objektträger aus Mikroskopglas (siehe Materialtabelle).
7. Trocknen Sie die Rutsche 1 h lang bei 37 °C.
   Hinweis: Lagern Sie die Gewebeschnitte bei 2–8 °C (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur bis zu 25 °C, um die Antigenität zu erhalten, und färben Sie sie innerhalb von 15 Tagen nach dem Schnitt.

2. Vorbereitung von zytologischen Proben

1. Bronchialwaschungen in einer Konservierungslösung auffangen (siehe Materialtabelle).
   Anmerkung: Hierfür wird die Standard-Bronchoskopietechnik verwendet.
   1. Lavage die Verteilung des zu beprobenden Bronchus. Sammeln Sie die Wäsche in einem sauberen Behälter. Beschriften Sie den Behälter mit dem Vor- und Nachnamen des Patienten, dem Geburtsdatum und der Probenquelle.
2. Übertragen Sie die Bronchialspülungen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und fügen Sie 2 g DL-Dithiothreitol-Pulver hinzu (siehe Materialtabelle), wirbeln Sie das Röhrchen 30 min lang vor und zentrifugieren Sie es dann bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 mL einer mukolytischen Lösung hinzu (siehe Materialtabelle).
4. Schütteln Sie die Probe 20 min lang bei mittlerer Geschwindigkeit (Stufe 9) und zentrifugieren Sie sie bei 250 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie das Zellpellet in Sammelröhrchen mit 10 % NBF ab.
6. Geben Sie 4 Tropfen eines Reagenzes zur Herstellung von Zellblöcken (siehe Materialtabelle) zum Zellpellet.
7. Übertragen Sie das Zellpellet in eine Kassette, fixieren Sie es in 10 % NBF und betten Sie es für die Vorbereitung und Teilung der Zellblöcke paraffineingebettet (siehe Schritte 1.1–1.7).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NovaPrep HQ1	Novacyt	Na	Konservierungslösung für Zytologie-Proben
Novaprep® HQ+ B	Novacyt	Na	Mukolytische Lösung
Tissue-Tek VIP 6	Sakura	6042 VIP 6
Tissue-Tek TEC 5 Tissue Einbetten eines Konsolensystems	Sakura	5229 TEC 5
Objektträger für Mikroskop SuperFrost Plus	Thermo Fisher Scientific	Artikel-Nr.: 4951PLUS4
DL-Dithiothreitol Pulver	Sigma-Aldrich	Nr. D3801
Heidolph Multi Reax Vortex-Schüttler	Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-889-410
Shandon-Zytoblock	Thermo Fisher Scientific	7401150