Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Lee, J. Y.et al., Präklinische Bewertung der Bioaktivität des Antikrebs-Cumarins OT48 durch Sphäroide, Koloniebildungsassays und Zebrafisch-Xenotransplantate.J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt den Koloniebildungs-Assay, der hilft, die Fähigkeit von Lungenkrebszellen zu bestimmen, sich unbegrenzt zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Wir können die Wirkung eines Antikrebsmittels auf die koloniebildenden Zellen analysieren, indem wir die Veränderungen in der Anzahl und/oder Größe der resultierenden Kolonien analysieren.

Protokoll

1. Assays zur Koloniebildung

1. Kultivieren Sie A549-Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/^cm2 in 15 ml RPMI1640 Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS (fetales Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm^2-Kolben in einem CO₂ -Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
2. Bestimmen Sie am Tag des Experiments die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 7 min in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl 1x steriler PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen.
3. Dispensieren Sie 1,1 ml halbfestes Medium auf Methylcellulosebasis (MCBM) in 15-ml-Röhrchen mit einer Multipipette. Bereiten Sie für jede Bedingung eine Tube vor.
4. Fügen Sie 110 μl FBS zu 1,1 ml MCBM mit einer P200-Mikropipette hinzu.
5. Sät Zellen mit 1.000 Zellen/ml. Sammeln Sie 2,4 μl Zellsuspension aus der Stammlösung (50.000 Zellen in 100 μl 1x PBS) mit einer P2-Mikropipette und fügen Sie es zu 1,1 ml MCBM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS.
6. Nachdem Sie die Zellen hinzugefügt haben, wirbeln Sie die Röhrchen 1 Minute lang vor und halten Sie sie vertikal mit höchster Geschwindigkeit, um MCBM und Zellen gut zu mischen.
7. Geben Sie Testverbindungen hinzu (OT48 allein oder in Kombination mit A1210477). Bereiten Sie ein separates Röhrchen zur Kontrolle des verwendeten Lösungsmittels (hier Dimethylsulfoxid (DMSO)) vor. Abhängig von der Konzentration der Verbindungen und dem für jede Bedingung hinzugefügten Volumen umfasst die Lösungsmittelkontrolle die höchste Konzentration des Lösungsmittels, die für die Verdünnungen der Prüfverbindung verwendet wird, um die durch das Lösungsmittel verursachten schädlichen Wirkungen zu beurteilen.
8. Wirbeln Sie die Schläuche für 1 Minute.
9. Geben Sie für jeden Assay 1 ml der Mischung mit einer P1000-Mikropipette in die mittlere Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte.
10. Füllen Sie leere Vertiefungen mit 1 mL sterilem Wasser oder 1x PBS, um die Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.
11. Kulturplatten 10 Tage lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren
12. Nach 10-tägiger Inkubation geben Sie 200 μl einer MTT-Stammlösung (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid) (5 mg/ml) in jede Vertiefung, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erreichen.
13. 10 min in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren. Lebensfähige Völker werden violett.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nr. A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest (Biowesten)	Nr. S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Zellkulturflasche T75	Spl	Artikel-Nr.: 70075	Rt
PBS-Lösung	Hyklon	SH30256.02	Rt
1,5 ml Tube	Extragen	Rohr-170-C	Rt
15 ml Tube	Hyundai Mikro	Nr. H20015	Rt
12-Well-Platte	Spl	Nr. 30012	Rt
MethoCult	StemCell-Technologien	Artikel-Nr.: 4230	-20 C°
Thiazolylblaues Tetrazoliumbromid (MTT-Pulver)	Sigma	Nr. M5622	4 C°
LAS4000	GE Technologies für das Gesundheitswesen		Rt