Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay: Eine Methode zur Bewertung der krebshemmenden Wirksamkeit von Therapeutika auf die Tumorigenität bei Zebrafischen in vivo

Zusammenfassung

Quelle: Lee, J. Y et al.,Präklinische Bewertung der Bioaktivität des Antikrebs-Cumarins OT48 durch Sphäroide, Koloniebildungsassays und Zebrafisch-Xenotransplantate.J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video beschreibt den Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay zur Beurteilung der in vivo Tumorbildung und zur Untersuchung der Wirkung von Therapeutika.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Zebrafisch-Xenotransplantat-Assay

HINWEIS: Dieser technische Ansatz wird als Schaltplan visualisiert (Abbildung 1).

1. Vorbereitung von Reagenzien
   1. Bereiten Sie 1 l 30x Danieau-Lösung vor: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄•7H2O, 18 mM Ca(NO₃)₂ und 150 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit einem pH-Messgerät auf 7,6 ein.
   2. 1%ige (50x) Tricainlösung herstellen: 20 mg Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (Tricain) in 2 ml destilliertem Wasser auflösen.
   3. Bereiten Sie 1%ige Phenolrot-PBS-Lösung vor: Geben Sie 2 μl Phenolrot-Natriumsalzlösung zu 198 μl sterilisierter PBS-Lösung in einem 1,5-μl-Röhrchen.
   4. Bereiten Sie 3% Methylcellulose vor: Fügen Sie 3 g Methylcellulose zu 100 ml 1x Danieau-Lösung hinzu.
2. Produktion und Inkubation von Zebrafisch-Eiern
   1. Trennen Sie einen weiblichen und einen männlichen Zebrafisch in einem Trennbecken, das mit UV-sterilisiertem und gefiltertem Leitungswasser bei 28,5 °C im Dunkeln gefüllt ist. Nach 24 Stunden Trennung werden Fische beider Geschlechter gemischt, um die Paarung einzuleiten. Übertragen Sie befruchtete Eier aus dem Begattungsbecken in eine Petrischale mit 5 ml frischer Danieau-Lösung.
   2. Waschen Sie die Eier dreimal mit 5 ml Danieau-Lösung. Für das Waschen die Eier vorsichtig mit einer Pipette absaugen und in 5 ml frische Lösung überführen. 8 h bei 28,5 °C inkubieren.
      1. Nach 8 Stunden Inkubation in Danieau-Lösung wechseln Sie zu Danieau-Lösung, die 0,03 % 1-Phenyl-2-thiharnstoff (PTU) enthält, um die Pigmentierung zu hemmen. Sortieren Sie undurchsichtige Eizellen (unbefruchtet oder mit unentwickelten Embryonen) aus, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Dechorionation des Embryos
   1. 24 h nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen mit einer scharfen Pinzette dechorionieren. Inkubieren Sie schlüpfende Embryonen in Danieau-Lösung mit 0,03 % PTU bei 28,5 °C bis 48 hpf.
4. Präparation mit Verbindungen behandelte Zellen
   1. A549-Zellen mit 20.000 Zellen/cm³² in 25 cm² Kulturkolben säen. Nach 24 h Aussaat Verbindungen (hier OT48 bei 50 μM und/oder A1210477 bei 20 μM) in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 h zugeben.
   2. Legen Sie die Behandlungszeit für jede Verbindung so fest, dass die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten bleibt, sie aber auf den Zelltod angewiesen sind. Dieser Zeitpunkt muss individuell auf der Grundlage der Zellviabilität, der Morphologie und der molekularen Marker festgelegt werden.
   3. 2 h vor Ende der Behandlung die Zellen mit 4 μM Fluoreszenz-Cell-Tracker-Farbstoff CM-Dil bei 37 °C und 5 % CO₂ färben. Nach 2 Stunden Inkubation trypsinisieren Sie die Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und verdünnen Sie 106 Zellen vor der Injektion in 50 μl Phenolrot-PBS-Lösung.
5. Mikroinjektion von Krebszellen zur Bildung von Xenotransplantaten
   1. Betäuben Sie Zebrafische in einer 0,02%igen Tricainlösung für 5 Minuten, bis sie sich auf einer Agarplatte niederlassen.
   2. Ziehen Sie eine 1,0 mm (Außendurchmesser (OD) Glaskapillare) mit einem Mikropipettenabzieher (Programmeinstellungen: P: 300, Hitze: 260, Zug: 60, VEL: 50 und Zeit: 200). Schneiden Sie die Mikrokapillare mit einer Spritze ein, um eine scharfe Kante zu erhalten. Mikrokapillaren mit 20 μl Zell-/Phenolrot-PBS-Lösung beladen. Stellen Sie den Injektionsdruck und die Zeit für die Abgabe von 2 nL pro Injektion ein.
   3. Injizieren Sie 100–200 Zellen in den Dottersack, indem Sie 6 bis 10 nL in 3 bis 5 Injektionen injizieren. Nach der Injektion lassen Sie den Fisch 10 bis 30 Minuten lang in 5 ml frischer Danieau-Lösung, die PTU-Lösung enthält, sich erholen. Die Fische werden in 24-Well-Platten mit 1 ml Danieau-Lösung, die PTU-Lösung enthält, abgefüllt und 72 Stunden lang bei 28,5 °C inkubiert.
   4. Nach 72 Stunden Inkubation den Fisch in einer 0,02%igen Tricainlösung anästhesieren und auf einem Objektträger mit einem Tropfen 3% Methylcellulose immobilisieren. Nehmen Sie 5x Bilder durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 nm auf.
   5. Quantifizieren Sie die Größe von fluoreszierenden Tumoren mit der ImageJ-Software. Wählen Sie das Menü "Analysieren | Messen". Speichern Sie die Werte, die dem Fluoreszenzsignal entsprechen, und analysieren Sie sie mit einer Statistiksoftware zur grafischen Darstellung.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Gesamtprozesses des Zebrafisch-Xenotransplantat-Assays.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nr. A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest (Biowesten)	Nr. S1520-500	-20 C°
Penicillin-Streptomycin	Lonza	17-602E	-20 C°
Zellkulturflasche T25	Spl	70025	Rt
Zellkulturflasche T75	Spl	Artikel-Nr.: 70075	Rt
Zellkulturflasche T175	Spl	Artikel-Nr.: 71175	Rt
1,5 ml Tube	Extragen	Rohr-170-C	Rt
24-Well-Platte	Spl	30024	Rt
Petrischale	Spl	Nr. 10100	Rt
PBS-Lösung	Hyklon	SH30256.02	Rt
Trypsin-EDTA	Gibco	Tel.: 25-300-054	4 C°
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 71382	Rt
Kaliumchlorid (KCL)	Sigma-Aldrich	Nr. P9541	Rt
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4,7H2O)	Sigma-Aldrich	Nr. M2773	Rt
Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	Nr. 1396	Rt
HEPES-Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. H0887	Rt
Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (Tricain)	Sigma-Aldrich	Nr. E10521	Rt
Phenolrot-Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. P0290	Rt
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	Nr. M0512	Rt
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)	Sigma-Aldrich	Nr. 7629	Rt
CM-Dil Farbstoff	Invitrogen	Nr. C7001	-20 C°
Glaskapillare	Welt Präzisionsinstrumente	TW 100F-4	Rt
Abzieher für Mikropipetten	Shutter-Instrument, USA	P-97	Rt
Mikro-Injektor	Welt Präzisionsinstrumente	PV820	Rt
Spritze	KOVAX	1 ml	Rt
Mikrolader	Eppendorf	5242956003	Rt
Glas-Rutsche	Marienfeld	Artikel-Nr.: HSU-1000612	Rt
Fluoreszenzmikroskopie	Leica	DE/DM 5000B	Rt