1. Synthese von Hyaluronsäure-Ceramid (HACE)
- Solubilizieren Sie 12,21 mmol Hyaluronsäure (HA)-Oligomer und 9,77 mmol Tetra-n-Butylammoniumhydroxid (TBA) in 60 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW). 30 Min. rühren.
- Um den DS-Y30-Linker zu synthetisieren, lösen Sie 8,59 mmol DS-Y30-Ceramid und 9,45 mmol Triethylamin in 25 ml Tetrahydrofuran (THF). Mit 8,59 mmol 4-Chlormethylbenzoylchlorid in THF mischen. 6 Std. bei 60 °C rühren.
- Die synthetisierten 8,10 mmol HA-TBA und 0,41 mmol DS-Y30-Linker werden in einem Gemisch aus THF und Acetonitril (4:1, v/v) gelöst. 5 Std. bei 40 °C rühren.
- Entfernen Sie Verunreinigungen durch Filtrieren mit einem Filtermittel und beseitigen Sie das organische Lösungsmittel durch Vakuumverdampfung. Das Produkt mit einer Dialysemembran (Molekulargewichtsgrenzwert: 3,5 kDa) reinigen und lyophilisieren.
2. Vorbereitung der Nanopartikel
- 1 mg HB und 1 mg Paclitaxel in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen und mit 0,5 ml DDW durch Vortex-Mischen für 5 min mischen. Lösen Sie dann HACE in dieser Mischung auf, indem Sie weitere 5 Minuten lang Vortex-Mischen durchführen.
- Um das Lösungsmittel zu entfernen, 4 Stunden lang bei 70 °C unter einem sanften Strom von Stickstoffgas erhitzen.
- Resuspendieren Sie den Film aus HACE, HB und Paclitaxel mit 1 ml DDW. Filtrieren Sie mit einem Spritzenvorsatzfilter (0,45 μm Porengröße), um unverkapselte Arzneimittel zu entfernen.
3. In-vitro-Phototoxizität
- Aufnahme von Nanopartikeln in Lungenkrebszelllinien
- Bereiten Sie RPMI-1640 Medium vor, das 10 % (v/v) fötales Rinderserum und 1 % (w/v) Penicillin-Streptomycin enthält.
- A549-Zellen werden in 24-Well-Zellkulturplatten mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Well gesät (Tripplikate für jede Gruppe). 24 Stunden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 und 95 % Luft inkubieren.
- Entfernen Sie nach der Zellanheftung das Medium und waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Löse die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 μM/ml HB auf. Inkubieren Sie dann die Zellen mit 1 ml PBS, leeren NPs, HB-NPs oder HB-P-NPs in jeder Vertiefung für 4 Stunden im Dunkeln.
- Entfernen Sie die gesamte Lösung und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml kaltes PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Frisches Nährmedium hinzufügen.
- Assay zur Zellviabilität
- Legen Sie die Zellkulturplatte unter die PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT-Faser zur Vertiefung). Tragen Sie eine Laserschutzbrille und beleuchten Sie die Zellen mit einem PDT-Laser (630 nm, 400 mW/cm 2) im Dunkeln für verschiedene Zeiträume: 0, 5, 10, 20, 30 und 40 Sekunden (0, 2, 4, 8, 12 und 16 J/cm2). Inkubieren Sie die Zellen dann 24 Stunden lang im Dunkeln.
- Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
- 10 μl Zytotoxizitätsmesslösung in jede Vertiefung geben. 2 Stunden im Dunkeln inkubieren.
- Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
