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Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Synthese von Hyaluronsäure-Ceramid (HACE)
- Solubilizieren Sie 12,21 mmol Hyaluronsäure (HA)-Oligomer und 9,77 mmol Tetra-n-Butylammoniumhydroxid (TBA) in 60 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW). 30 Min. rühren.
- Um den DS-Y30-Linker zu synthetisieren, lösen Sie 8,59 mmol DS-Y30-Ceramid und 9,45 mmol Triethylamin in 25 ml Tetrahydrofuran (THF). Mit 8,59 mmol 4-Chlormethylbenzoylchlorid in THF mischen. 6 Std. bei 60 °C rühren.
- Die synthetisierten 8,10 mmol HA-TBA und 0,41 mmol DS-Y30-Linker werden in einem Gemisch aus THF und Acetonitril (4:1, v/v) gelöst. 5 Std. bei 40 °C rühren.
- Entfernen Sie Verunreinigungen durch Filtrieren mit einem Filtermittel und beseitigen Sie das organische Lösungsmittel durch Vakuumverdampfung. Das Produkt mit einer Dialysemembran (Molekulargewichtsgrenzwert: 3,5 kDa) reinigen und lyophilisieren.
2. Vorbereitung der Nanopartikel
- 1 mg HB und 1 mg Paclitaxel in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen und mit 0,5 ml DDW durch Vortex-Mischen für 5 min mischen. Lösen Sie dann HACE in dieser Mischung auf, indem Sie weitere 5 Minuten lang Vortex-Mischen durchführen.
- Um das Lösungsmittel zu entfernen, 4 Stunden lang bei 70 °C unter einem sanften Strom von Stickstoffgas erhitzen.
- Resuspendieren Sie den Film aus HACE, HB und Paclitaxel mit 1 ml DDW. Filtrieren Sie mit einem Spritzenvorsatzfilter (0,45 μm Porengröße), um unverkapselte Arzneimittel zu entfernen.
3. In vivo Wirksamkeit gegen Krebs bei tumortragenden Mäusen
- Lungenkrebs-induziertes Mausmodell
- 1 × 106 A549-Zellen in 0,1 ml RPMI-1640 Medium vorbereiten und in Eis aufbewahren.
- Betäuben Sie die Mäuse mit einer i.p. Injektion eines Xylazins und einer Mischung aus Tiletamin und Zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung, indem Sie vorsichtig eine kleine Falte der Maushaut zusammendrücken. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
Anmerkung: Wenn keine Bewegung beobachtet wird, wird das Tier ausreichend betäubt, um mit den Versuchen zu beginnen.
- Injizieren Sie die Zellen subkutan in die linken Flanken von BALB/C-männlichen Nacktmäusen (6 - 7 Wochen alt, 20 - 22 g).
- Beobachten Sie die Mäuse so lange, bis sie sich im Käfig zu bewegen beginnen.
Anmerkung: Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat. Halten Sie die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen.
- Messen Sie täglich die Tumorgröße mit Messschiebern. Berechnen Sie das Tumorvolumen (mm 3) als (Länge × Breite2) / 2. Wenn die Tumorgröße ein Volumen von etwa 200 mm3 erreicht, starten Sie das Experiment.
- Studie zur Wirksamkeit von Krebs
- Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen ein (n = 10 für jede Gruppe).
- Betäuben Sie die Mäuse mit einer i.p. Injektion eines Xylazins und einer Mischung aus Tiletamin und Zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung, indem Sie vorsichtig eine kleine Falte der Maushaut zusammendrücken. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
Anmerkung: Wenn keine Bewegung beobachtet wird, wird das Tier ausreichend betäubt, um mit den Versuchen zu beginnen.
- Lösen Sie die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml HB auf. Injizieren Sie PBS, freie HB, HB-NPs oder HB-P-NPs zweimal an den Tagen 0 und 7 über die Schwanzvene (2 mg/kg als HB).
- Beobachten Sie die Mäuse so lange, bis sie sich im Käfig zu bewegen beginnen.
Anmerkung: Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat. Bewahren Sie die Käfige dunkel und unter bestimmten Lichtschutzfaktorbedingungen auf.
- 24 Stunden nach jeder Injektion betäuben Sie die Mäuse mit einer i.p. Injektion von Xylazin und einer Mischung aus Tiletamin und Zolazepam (1:2, 1 ml/kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung, indem Sie vorsichtig eine kleine Falte der Maushaut zusammendrücken. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
Anmerkung: Wenn keine Bewegung beobachtet wird, wird das Tier ausreichend betäubt, um mit den Versuchen zu beginnen.
- Platzieren Sie die Tumorstelle unter der PDT-Faser (mit einem Abstand von 1 cm von der PDT-Faser zum Tumor). Tragen Sie eine Laserschutzbrille, schalten Sie den Schalter aus und beleuchten Sie den Tumor zweimal an den Tagen 1 und 8 für 500 sec (200 J/cm2) mit einem PDT-Laser (630 nm, 400 mW/cm2).
- Beobachten Sie die Mäuse so lange, bis sie sich im Käfig zu bewegen beginnen. Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Geben Sie ein Tier, das operiert wurde, nicht an andere Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat.
- Bewahren Sie die Käfige unter Lichtschutzfaktor-Bedingungen auf. Bewahren Sie die Käfige nach der Laserbehandlung 24 Stunden lang im Dunkeln auf.
- Überwachen Sie täglich das Tumorvolumen und die Veränderungen an der Tumorstelle. Messen Sie die Tumorgröße mit einem Messschieber und berechnen Sie das Volumen als (Länge × Breite2) / 2 (mm3). Machen Sie jeden Tag Fotos von den Tumorstellen, um nach der PDT nach Veränderungen der Tumoroberfläche zu suchen.
- An Tag 16 werden fünf Mäuse pro Gruppe durch terminale Anästhesie mit Isofluran geopfert.
- Schneiden Sie mit Pinzette und Schere die Außenhaut auf und legen Sie die Tumore frei. Ernte sie sorgfältig. Fixieren Sie sie in 10 % Formalin, betten Sie sie in Paraffin ein und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für die histologische Analyse.
- Nach 45 Tagen Überwachung töten Sie die verbleibenden Mäuse durch terminale Anästhesie mit Isofluran.