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Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Lungeninstillation
- Wählen Sie eine handelsübliche 20 g lange intravenöse Kanüle aus, die Sie für die Intubation verwenden möchten.
- Modifizieren Sie die Katheterspitze manuell und biegen Sie sie, um eine leichte Krümmung an der Spitze zu erzeugen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Betäuben Sie die Maus mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (15 mg/kg), die IP injiziert wurde, und bestätigen Sie die Anästhesie durch Abwesenheit von Reflexbewegungen. Tragen Sie unmittelbar nach der Anästhesie Tiersalbe auf die Augen auf. Tragen Sie unmittelbar nach der Anästhesie tierärztliche Salbe auf die Augen auf und geben Sie Carprofen (5-10 mg/kg SQ) für die postoperative und Instillationsanalgesie.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer schrägen Plattform. Wie in Abbildung 2 gezeigt, funktioniert ein großer Büroordner mit aufgeklebten Nahtschlaufen sehr gut.
- Rasieren Sie den ventralen Teil des Halses und reinigen und desinfizieren Sie den Halsbereich mit 70% Alkohol. Verwenden Sie mit neuen latex- und puderfreien Handschuhen chirurgische Instrumente, die mit 70% Alkohol desinfiziert sind.
- Machen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen chirurgischen Schnitt im Hals etwa 12 mm unterhalb des unteren Schneidezahns.
- Ziehen Sie mit einer Pinzette sanft an der Haut im Nacken kaudal, bis die Bauchwand der Luftröhre zu sehen ist.
- Ziehen Sie die Zunge vorsichtig zurück und führen Sie die Kanüle so ein, dass die gebogene Spitze zur Bauchfläche der Maus geneigt ist. Wie in 1.4 wird im Nacken sanft an der Haut gezogen und die Kanüle in die Luftröhre eingeführt
Anmerkung: Mit ein wenig Übung wird der Katheter sichtbar sein, der sich die Luftröhre hinunter bewegt. Wenn es in die Speiseröhre gelangt, kann die Bewegung des Katheters nicht visuell gesehen werden. Es werden keine Schnitte in der Luftröhre vorgenommen.
- Sobald der Katheter in der Luftröhre im Nacken zu sehen ist, wird er etwa 5 mm vorgeschoben, um zuverlässig durch die Stimmbänder geführt zu werden, aber immer noch weit über der Carina.
- Bereiten Sie sich darauf vor, bis zu 50 μl Flüssigkeit zu instillieren, indem Sie mit einer Pipettenspitze zum Gelladen durch den Katheter injizieren. Platzieren Sie die Spitze in der Luer-Nabe, aber schauen Sie vor der Injektion genau hin, um die Bewegung der Flüssigkeit in der Spitze synchron mit der Atmung der Maus zu beobachten. Injizieren Sie dann das Instillat.
- Mit einer 1-ml-Spritze blasen Sie sofort relativ schnell 0,6 ml Luft durch den Katheter in die Lunge, um die Flüssigkeit tief in der Lunge zu verteilen. Entfernen Sie die Kanüle.
- Entfernen Sie die Kanüle.
- Verwenden Sie eine kleine Menge Cyanacrylat-Klebstoff, um die kleine Operationswunde gemäß den Anweisungen in der Packungsbeilage für VetBond zu verschließen. Setzen Sie Mäuse in einzelne Käfige und überwachen Sie sie visuell, bis sie aufwachen und sich normal verhalten, ohne Anzeichen von Beschwerden.
2. Messung des festen Lungenvolumens
- Messen Sie das Lungenvolumen nach dem Archimedes-Prinzip, wie in Abbildung 3 dargestellt. Entfernen Sie die fixierte Lunge vom Formaldehyd und präparieren Sie das Herz und alle anderen Gewebe, die nicht zur Lunge gehören.
- Verwenden Sie eine zuvor konstruierte, einfache, selbstgemachte Drahtstütze, die dazu dient, die Lunge vollständig unter Wasser zu halten.
Anmerkung: Dieses Gerät muss mit der verwendeten Waage kompatibel gemacht werden. Ein typisches Gerät, das in Abbildung 4 gezeigt wird, besteht aus Kunststoffpipetten und dünnem (20 G) Draht. Dieses System funktioniert gut mit der im Video verwendeten Waage, könnte aber leicht an die meisten Laborwaagen angepasst werden.
- Ein Becherglas mit ≈200 ml Wasser auf die Waage stellen und mit dem Stützkäfig im Wasser tarieren. Siehe Abbildung 5. Entfernen Sie den Metallkäfig; Legen Sie die Lunge auf die Wasseroberfläche und drücken Sie sie mit dem Käfig unter Wasser.
- Notieren Sie das Gewicht auf der Waage. Diese Zahl spiegelt das Volumen des verdrängten Wassers wider und ist somit ein direktes Maß für das Lungenvolumen. Achten Sie darauf, dass die Lunge oder die Naht oder ein Teil des Drahtkäfigs nicht die Seiten oder den Boden des Bechers berührt.
- Wiederholen Sie diese Messung, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Nehmen Sie die Lunge aus dem Wasser und trocknen Sie sie auf einem Taschentuch ab. Den Becher mit aufgesetztem Käfig wieder anbraten und die Lungenvolumenmessung wiederholen. Die beiden Volumenmessungen sollten dann gemittelt werden.
Anmerkung: Wenn die Lunge länger als etwa eine Woche im Formalin verbleibt, wird die Luft in der Lunge in der Flüssigkeit aufgelöst. In diesem Fall sinkt die Lunge ab, so dass es nicht mehr notwendig ist, ein Gerät wie in Abbildung 4 zu verwenden, um die Lunge unter Wasser zu halten. In diesem Fall kann das Volumen einfach gemessen werden, indem die Lunge an einem der Nahtfäden gehalten wird, bis sie vollständig untergetaucht ist, wie in Abbildung 3 dargestellt.
