Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Jove Veterinary Review Board überprüft
>1. Vorbereitung der Transplantationsausrüstung und des Operationstisches
HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sollten autoklaviert und der Operationstisch und die Instrumente mit 70% Alkohol desinfiziert werden.
- Verbinden Sie einen stereotaktischen Kopfhalter über eine Nasenmaske mit der Anästhesie und schalten Sie das Heizkissen ein.
- Verbinden Sie eine gasdichte Hamilton-Spritze mit einem Polyethylenschlauch und einer Augenkanüle mit stumpfem Ende.
Anmerkung: Es wird empfohlen, alle Teile vor der Montage mit PBS zu füllen. Auf eingeschlossene Luftblasen prüfen und ggf. entfernen.
- Befestigen Sie die Hamilton-Spritze fest am Tisch (Abbildung 1a) oder an einer beweglichen Basis (Abbildung 1e) und befestigen Sie den Schlauch am Stereomikroskop, wobei die Kanüle nach unten hängt (d. h. in Warteposition).
Anmerkung: Verwenden Sie chirurgisches Klebeband, da es leicht zu entfernen und wieder anzubringen ist.
- Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze vor, die mit einer 30-g-Nadel verbunden ist, die mit 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung gefüllt ist.
- Bereiten Sie eine Spritze mit sterilem PBS vor. Alternativ können Sie auch eine Pipette verwenden.
- Stellen Sie einen sauberen Weckkäfig mit einer Heizlampe beiseite.
2. Anästhesie und Positionierung von Empfängermäusen für die Operation
HINWEIS: Alle Tiere wurden in einer pathogenfreien Umgebung in den Tiereinrichtungen der Universität Lund gezüchtet und gehalten.
- Betäuben Sie die Maus in einer mit 40 %Ø 2/60 % N2/3 % Isofluran gefüllten Kammer und übertragen Sie die anästhesierte Maus auf einem warmen Heizkissen auf die Kopfhalterungsplattform (Abbildung 1a). Überprüfen Sie, ob die Pedalreflexe fehlen.
Anmerkung: Die Isofluran-Anästhesie ist die bevorzugte Anästhesiemethode für eine schnelle Genesung nach der Operation. Der Mikroskopraum muss gut belüftet werden, um Isofluran zu verwenden.
- Platzieren Sie die Schnauze der Maus in der Anästhesiemaske, die mit einem Anästhesiegerät von 40 % O2 /60 % N2 von 0,9 % bis 1,5 % Isofluran verbunden ist. Hebe den Kopf mit Daumen und Finger leicht nach oben und befestige ihn mit den Metallteilen an den Seiten. Achten Sie darauf, dass die Ohrmuscheln den Kopf direkt unter den Ohren fixieren. 0,1 mg/kg Buprenorphinlösung subkutan auf den Rücken der Maus injizieren.
Anmerkung: Buprenorphin wird als Analgetikum verwendet.
- Neigen Sie den Kopf so, dass das zu operierende Auge nach oben zeigt und sich nahe am Forscher befindet.
- Ziehen Sie die Augenlider des zu transplantierenden Auges vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette zurück, ziehen Sie das Auge heraus und fixieren Sie es locker mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Pinzette mit einem Polyethylenrohr bedeckt sind, das an der Kopfhalterplattform befestigt ist (Abbildung 1a, Einschub).
- Halten Sie immer beide Augen feucht, indem Sie einen Tropfen steriles PBS auf das Auge auftragen.
- Übertragen Sie die menschlichen Inselzellen aus dem verschlossenen 1,5-ml-Röhrchen (Abschnitt 1) in eine Petrischale mit sterilem PBS und stellen Sie sicher, dass sich die Inselzellen nahe beieinander befinden, um die Menge des übertragenen Zellkulturmediums zu minimieren (Abbildung 1c).
- Nehmen Sie ~20–30 Inselzellen in der Augenkanüle auf, die über einen Polyethylenschlauch mit der Hamilton-Spritze verbunden ist.
Anmerkung: Nehmen Sie mit den Inselchen so wenig Flüssigkeit wie möglich auf.
- Hängen Sie den Schlauch kopfüber auf und befestigen Sie ihn am Stereomikroskop (Abbildung 1d). Klebe den Schlauch vorsichtig ab, damit die Inselchen bis zum Ende des Schlauchs in Richtung Kanüle absinken
.
>3. Ablauf der Transplantation
HINWEIS: Diese Methode wurde bereits für die Transplantation von Mausinseln beschrieben. Ein leicht modifiziertes Verfahren wird hier vorgestellt.
- Kneifen Sie die Ballen an den Hinterbeinen zusammen, um sicherzustellen, dass die Maus schläft.
- Ziehen Sie die Pinzette fest, die das Auge festhält, ohne den Blutfluss zu unterbrechen, und tragen Sie einen Tropfen steriles PBS auf das Auge auf.
- Mit einer 25-G-Nadel als Skalpell nach oben abschrägen, vorsichtig nur die Hälfte der Spitze in die Hornhaut eindringen und einen einzigen seitlichen Schnitt vornehmen. Machen Sie das Loch in einem Winkel nach oben; Das Loch lässt sich nach der Transplantation leichter verschließen (Abbildung 1f).
- Heben Sie die Hornhaut vorsichtig mit der mit Inselzellen vorgeladenen Kanüle an und tragen Sie langsam Inselchen im Auge auf. Vermeiden Sie das Einführen der Kanüle in die Vorderkammer, um eine Beschädigung der Iris zu vermeiden, sondern drücken Sie vorsichtig gegen die Hornhautöffnung (Abbildung 1g). Ziehen Sie die Kanüle langsam aus der ACE zurück.
Anmerkung: Streben Sie ein Injektionsvolumen von 3–8 μl an. Wenn das Volumen zu groß ist, setzt es das Auge einem unnötig hohen Augeninnendruck aus und kann zu einem Rückfluss der injizierten Inselzellen aus der Vorderkammer führen.
- Wenn Sie aufgrund des erhöhten Drucks in der Augenkammer Schwierigkeiten beim Einsetzen der Inselzellen haben, vergrößern Sie die Inzisionsstelle, indem Sie die laterale Inzisionsstelle verstärken, und bringen Sie die Inselzellen erneut an.
Anmerkung: Gelegentlich können eingebrachte Luftblasen als Platzhalter verwendet werden.
- Tragen Sie Augengel auf das Auge auf, lösen Sie die augenfixierende Pinzette und lassen Sie die Maus auf Isofluran 8–10 Minuten lang in der gleichen Position, damit die Inselchen aushärten können.
- Entfernen Sie die Pinzette, die das Augenlid hält, und bringen Sie das Augenlid wieder in seine normale Position.
- Nehmen Sie die Maus aus der Kopfhalterung und stellen Sie sie in einen Weckkäfig.
- Wenn die Maus wach ist und sich bewegt, setzen Sie sie zurück in den ursprünglichen Käfig und bewahren Sie sie bis zum Scannen im Tierstall auf (mindestens 5 Tage werden empfohlen).
