1. Organoidkultur und Präparate vor der Elektroporation
- Etablierung von Organoiden durch Gewebeverdauung, wie zuvor beschrieben, und Erweiterung mit dem entsprechenden entitätsspezifischen Kulturmedium in einer Basalmatrix, Übersicht siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien
Anmerkung: Für menschliche Gewebeproben ist eine informierte Einwilligung und Genehmigung der Studie durch eine Ethikkommission erforderlich.
- 48-Well-Platten bei 37 °C für die Nachsaat nach der Elektroporation vorwärmen.
- Herstellung des Basalmediums ohne Antibiotika sowie des entitätsspezifischen Organoid-Kulturmediums ohne Antibiotika (siehe Tabelle 1), einschließlich 10 μM Y-27632 und 3 μM CHIR99021,
Anmerkung: Der Entzug von Antibiotika ist wichtig, um toxische Wirkungen zu reduzieren. Y-27632 und CHIR99021 verbessern die Zellregeneration.
- Aufbereitung der Organoide (siehe Abbildung 1)
- Kultivieren Sie 5 Vertiefungen mit Organoiden in einer 48-Well-Platte pro Elektroporationsprobe in Kulturmedium.
Anmerkung: Es sollten proliferative Organoide verwendet werden (ca. 2-3 Tage nach der letzten Spaltung).
- Bereiten Sie 230 μl Dissoziationsreagenz vor (siehe Materialtabelle), einschließlich 10 μM Y-27632 pro Well.
- Das Nährmedium wird aus jeder Vertiefung entnommen und die Organoide mechanisch in 230 μl der vorbereiteten Dissoziationsmischung dissoziiert. Füllen Sie 5 Vertiefungen pro Elektroporationsprobe in ein 15-ml-Röhrchen.
- Durch Vortexen mischen und 5-15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis Cluster von 10-15 Zellen entstehen. Überprüfen Sie daher die Dissoziation mikroskopisch. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von Basalmedium ohne Antibiotika bis zu 10 mL.
Anmerkung: Dieser Schritt ist sehr wichtig! Die Effizienz der Elektroporation wird verringert, wenn die Inkubation zu kurz ist, aber ein langer Aufschluss verringert die Überlebensfähigkeit.
Bei - 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, den Überstand verwerfen und zweimal mit 4 mL Elektroporationspuffer waschen (siehe Materialtabelle).
>2. Elektroporation
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für Elektroporatoren entwickelt, die Rechteckwellen und getrennte Poren- und Transferpulssequenzen verarbeiten können (siehe Abbildung 2). Optional können Impedanzwerte sowie die in die Probe übertragenen Spannungen, Ströme und Energien als Kontrolle für reproduzierbare Experimente gemessen werden.
- Resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in 100 μl Elektroporationspuffer (siehe Materialtabelle), der 30 μg Plasmid-DNA enthält.
Anmerkung: Die Konzentration der verwendeten Plasmid-DNA sollte 5 μg/μL überschreiten, um eine optimale Salzkonzentration während des Elektroporationsprozesses zu erreichen. Daher werden endofreie Plasmid-Maxi-Kits (siehe Materialtabelle) für die Herstellung von Vektoren empfohlen. Eine Gesamtmenge von bis zu 45 μg DNA kann ohne zytotoxische Effekte verwendet werden.
- Das komplette DNA-Organoid-Gemisch wird in eine Elektroporationsküvette mit 2 mm Spaltbreite abgefüllt, ohne dass Luftblasen entstehen.
- Stellen Sie die Elektroporationsparameter ein (siehe Tabelle 2, Abbildung 2).
- Mischen Sie die Zellen leicht ohne Schaumbildung an, indem Sie mit dem Finger auf die Küvette klopfen. Setzen Sie die Küvette in die Küvettenkammer ein.
- Drücken Sie die Ω Taste des Elektroporators und notieren Sie sich den Impedanzwert.
Anmerkung: Eine Impedanz zwischen 30-40 Ω zeigte die besten Ergebnisse. Im Allgemeinen sollte es im Bereich zwischen 30-55 Ω liegen. Ist dies nicht der Fall, kontrollieren Sie bitte folgende Aspekte: Spaltbreite der verwendeten Küvette, Kabelanschlüsse des Elektroporators, mögliche Luftblasen, korrektes Volumen und Salzkonzentration des Elektroporationsgemisches.
- Drücken Sie die Start-Taste, um das Elektroporationsprogramm auszuführen und die angezeigten Werte von Strömen, Spannungen und Energien zu steuern.
Anmerkung: Die Werte der gemessenen Spannungen, Ströme und Energien sollten den eingestellten Elektroporationsparametern entsprechen. Für den Vergleich von wiederholten Experimenten kann es hilfreich sein, diese Daten zu notieren.
- Nach der Elektroporation sofort 500 μl Kulturmedium ohne Antibiotika zugeben (mit CHIR99021 und Y-27632; siehe Schritt 1.3). Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren, um den weißen Schaum zu dissoziieren.
Anmerkung: Nach dem Elektroporationsprozess entsteht der weiße Schaum und eine beträchtliche Anzahl von Zellen wird daran befestigt. Daher ist die Dissoziation davon sehr wichtig, um keine Zellen zu verlieren.
- Übertragen Sie die Probe vollständig aus der Küvette in ein neues 15-ml-Röhrchen mit der Pipette der Elektroporationsküvetten (siehe Materialtabelle). Es wird empfohlen, die Küvette erneut mit Basalmedium zu spülen, um verbleibende Zellen zu erhalten.
- Zur Regeneration der Zellen inkubieren Sie sie 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.
>3. Aussaat von Zellen
- Die Zellen werden bei 450 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl Kellermatrix und säen Sie 20 μl Tropfen in eine vorgewärmte 48-Well-Platte (siehe Schritt 1.2). Inkubieren Sie 10 min bei 37 °C für die Polymerisation und fügen Sie 250 μl Kulturmedium hinzu, das mit Y-27632 ergänzt wird und bis zur nächsten Spaltung der gezüchteten Organoide (ca. 5-7 Tage) CHIR99021.
>4. Bestimmung der Transfektionseffizienz
HINWEIS: Im Allgemeinen wird empfohlen, einen Vektor mit einem Fluoreszenzmarker als zusätzliche Transfektionskontrolle zu elektroporieren. Abhängig vom gewählten Marker und seiner Chromophorreifung ist die Fluoreszenz innerhalb von etwa 24-48 Stunden nach der Transfektion sichtbar18.
- Überprüfen Sie die Fluoreszenz mikroskopisch nach 24-48 h in der Transfektionskontrolle (Abbildung 3B)
Tabelle 1: Zusammensetzung von Basalmedien, Aufschlussmischungen und Kultivierungsmedien.
| Bestandteile des Basalmediums: | Ich | Ii |
| Erweitertes DMEM/F-12 | - | - |
| Glutamax | 1x | 1x |
| Hepes | ca. 10 mM | ca. 10 mM |
| Penicillin Streptomycin | - | 1x |
| Primocin | 1x | - |
| Etablierung durch Verdauung |
| Aufschluss-Mix: | Doppelpunkt | Magen | Leber | Bauchspeicheldrüse |
| normal | tumorhaft | normal | tumorhaft | normal | tumorhaft | normal | tumorhaft |
| Kollagenase II | - | - | - | - | - | 0,625 mg/ml |
| Kollagenase XI | - | 0,1 mg/ml | - | 0,1 mg/ml | - | - |
| Kollagenase D | - | - | - | - | 2,5 mg/ml | - |
| Dispase II | - | 1 mg/ml | - | 1 mg/ml | - | 2,5 mg/ml |
| DNase I | - | - | - | - | 0,1 mg/ml | - |
| Edta | 2mM | - | 10 Mio. | - | - | - |
| Verdünnt in | Chelatbildender Puffer* | Basalmedium I | Chelatbildender Puffer* | Basalmedium I | in EBSS | Basalmedium I |
| Inkubation für: | 0,5 h auf Eis | 1h bei 37°C | 0.25-0.5 h bei RT | 1h bei 37°C | 0,5-1 h bei 37°C | 1.5 h bei 37°C | 0,5-1 bei 37 °C | 2-3 h bei 37°C |
| Adaptiert von der Referenz: | Sato et al. 2011 | Bartfeld et al. 2015 | Broutier et al. 2016 | Hennig et al. 2019 |
| Kultivierungsmedium (Basis: Basalmedium II) |
| Nr. A83-01 | 0,5 μM | 2 μM | 5 μM | 0,5 μM |
| Nr. B27 | 1x | 1x | 1x | 1x |
| B27 ohne Vitamin A | - | - | 1x | - |
| Forskolin | - | - | 10 μM | - |
| hFGF-10 | - | 200 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml |
| hHGF | - | - | 25 ng/ml | - |
| [Leu15] Gastrin | 10 nm | 1 nM | 10 nm | 10 nM |
| mEGF | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml |
| N2 | - | - | 1x | - | 1x |
| N-Acetyl-L-Cystein | ca. 1,25 Mio. | 1 mM | 1 mM | 1 mM |
| Nikotinamid | ca. 10 mM | ca. 10 mM | ca. 10 mM | 10 mM |
| Birne | 10 % | 10 % | - | 10 % |
| Primocin | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) | 1x (100 μg/ml) |
| Prostaglandin E2 | 10 nm | - | - | - | 1 μM |
| Rspondin | 20 % | 10 % | 10 % | 10 % |
| SB202190 | 3μM | - | - | - |
| Wnt3A | 50 % | 50 % | - | 50 % |
| *Chelatbildender Puffer: 5,6 mM Na2HPO4, 8,0 mM KH2PO4, 96,2 mM NaCl, 1,6 mM KCl, 43,4 mM Saccharose, 54,9 mM d-Sorbit, 0,5 mM dl-Dithiothreitol in destilliertem Wasser |
