1. Verdauung von Pankreastumoren
- Legen Sie den präparierten Pankreastumor, Tumoren an der metastasierten Stelle oder gesundes Pankreasgewebe in eiskaltes PBS und lagern Sie ihn auf Eis.
- Übertragen Sie den Tumor mit einer Pinzette auf eine Petrischale.
- 5,0 ml Aufschlussmedium (2 mg/ml Kollagenase, 0,025 mg/ml DNase RPMI) in ein 50 ml Röhrchen geben; auf Eis lagern, um den Beginn der Enzymaktivität zu verhindern.
Anmerkung: In diesem Protokoll wird Kollagenase Typ V verwendet, die eine Aktivität von ≥1 Einheiten/mg FALGPA und > 125 Kollagenaufschlusseinheiten (CDU)/mg Feststoff aufweist. Kollagenase und DNase Aliquots können bei -20 °C gelagert und vor der Verwendung auf Eis aufgetaut werden. Wenn beide vollständig in sterilem RPMI gelöst sind, können sie durch einen 0,2-μm-Filter geleitet werden, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Kollagenase muss vor dem Filtern vollständig gelöst werden, um Materialverlust zu vermeiden.
- Nehmen Sie ein kleines Aliquot dieser Lösung, um den Tumor auf der Petrischale zu bedecken.
- Schneide den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette in kleine Stücke von etwa weniger als 3 mm Länge.
- Kratzen Sie die Tumorstücke in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, bis alle Stücke in Verdauungsmedium eingetaucht sind. Auf Eis lagern, wenn andere Tumorproben in einer Charge vorbereitet werden müssen.
- Für 20 Minuten bei 37 °C auf ein Schüttelgerät umfüllen. Stellen Sie sicher, dass alle Tumorstücke untergetaucht sind und nicht am Rand des Röhrchens kleben. Wenn ein Schütteln nicht möglich ist, wirbeln Sie die Probe alle 5 Minuten vortexen, um die Verdauung zu unterstützen.
2. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus verdautem Tumor
- Stellen Sie das Röhrchen unmittelbar nach dem Verdauungsschritt auf Eis, um die Enzymaktivität zu verlangsamen.
- Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und führen Sie die Probe kurz zum Mischen in einen Vortex. Dadurch wird die Enzymaktivität weiter verlangsamt.
- Öffnen Sie das Röhrchen und spülen Sie den Deckel des Röhrchens mit frischem RPMI-Medium ab.
- Bereiten Sie ein 70-μm-Sieb (die μm-Größe des Siebs kann nach Belieben geändert werden) auf einem offenen 50-ml-Röhrchen auf Eis vor.
- Befeuchten Sie den Filter mit Medium.
- Resuspendieren Sie die verdauten Zellen und waschen Sie die Seiten des Röhrchens mit einem 25-ml-Streifen oder größer. Die breitere Öffnung der Stripette ist wichtig, damit der dicke Aufschluss leicht passieren kann.
- Übertragen Sie den gesamten Aufschluss mit dem 25-ml-Stripette auf das Sieb.
- Zerdrücken Sie den Tumor auf dem Filter mit einem 1-ml-Spritzenkolben. Maischen Sie nur direkt auf und ab, um die Scherspannung auf die Zellen zu minimieren.
- Waschen Sie die Zellen kontinuierlich mit RPMI durch das Sieb. Achten Sie darauf, mit genügend Kraft zu waschen, um die Zellen hindurchzudrücken.
- Wenn noch Material zu maischen ist, aber das RPMI nicht mehr durchgespült wird, ist das Sieb gesättigt. Übertragen Sie daher die Probe in einen neuen Filter und fahren Sie fort.
Anmerkung: Schließlich verbleiben nur noch extrazelluläre Matrixkomponenten im Filter, alle einzelnen Zellen sollten hindurchgegangen sein.
- Das Röhrchen 5 min bei 300 x g und 4 °C zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in vollständiger RPMI und passieren Sie es direkt durch einen anderen Filter, um extrazelluläre Matrix oder große Zellklumpen zu entfernen, die nicht ausreichend resuspendiert werden können.
- Wenn zu diesem Zeitpunkt keine Stimulation erforderlich ist, färben Sie die isolierten Zellen sofort für die Durchflusszytometrie-Analyse, indem Sie die Platte 5 Minuten lang bei 300 x g und 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte mit einer scharfen Bewegung auf den Kopf stellen. Alternativ können sie in Gefriermedium (10 % DMSO in FBS) resuspendiert und bei -80 °C gelagert werden, gefolgt von einer Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff.
Anmerkung: Der Gefrierschritt kann die Reinigung von Immunzellen zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen; Die Quantifizierung von Immunzelluntergruppen erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung, um zu bestätigen, dass die Zellzahl und der Phänotyp nicht durch den Einfrieren/Auftauen beeinflusst werden. Die ex vivo T-Zell-Stimulation wird am besten an frischen Tumorproben durchgeführt. An diesem Punkt kann die Probe bei Bedarf durch eine beadbasierte Entfernung von toten Zellen oder Immunzellanreicherungsassays weiter gereinigt werden.
3. Zellen für die ex vivo-Stimulation vorbereiten
- Zählen Sie die Zellen, um eine Konzentration von 2 x 106/ 100 μL im Vollmedium (RPMI 10 % FBS, 1X Penicillin und 1X Streptomycin) zu erreichen.
Anmerkung: Die hohe Anzahl der insgesamt plattierten Zellen stellt sicher, dass in dieser Probe ausreichend T-Zellen für die Analyse vorhanden sind. Die Anzahl kann jedoch je nach Probenverfügbarkeit und der Seltenheit der interessierenden T-Zell-Untergruppen nach oben oder unten skaliert werden.
- Platte 100 μl Zellen in einer 96-Well-Platte mit U-Boden.
- 100 μl vollständiges Medium zugeben, das ein 2x Präparat PMA/Ionomycin enthält (um eine Endkonzentration von 0,081 μM bzw. 1,34 μM zu erreichen, wie vom Hersteller empfohlen).
Anmerkung: Bei der Messung von Degranulation/Exozytose ist auch hier ein fluoreszierend konjugiertes Anti-Maus-CD107a in das Medium aufzunehmen. Eine Kontrollprobe, die kein CD107a enthält, muss ebenfalls durchgeführt werden.
- In einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 1 h stellen.
- Geben Sie 20 μl eines 10-fachen Präparats aus Brefeldin A und Monensin (um eine Endkonzentration von 1,06 μM bzw. 2,0 μM (wie vom Hersteller empfohlen) in ein vollständiges Medium zu erreichen.
Anmerkung: Brefeldin A und Monensin sind Proteintransportinhibitoren und blockieren somit die extrazelluläre Freisetzung von Zytokinen usw., was deren Nachweis durch Durchflusszytometrie ermöglicht. Wenn Sie die Zytokinfreisetzung in den Überstand mit ELISA oder ähnlichen Methoden messen, kann dieser Schritt übersprungen werden.
- Stellen Sie die Platte für weitere 4 h in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2.
