Bildgebung der Kalziumdynamik in Pankreaszellen: Eine Technik zur Untersuchung von Echtzeitänderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration auf der Pankreasinsel

Zusammenfassung

Quelle: Hamilton, A., et. al. Bildgebung der Kalziumdynamik in Subpopulationen von Pankreas-Inselzellen der Maus. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Abbildung von Inselzellen in Echtzeit, um die Veränderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration in den kleineren Subpopulationen der Pankreas-Inselzellen zu untersuchen. Kleinere Zellsubpopulationen können anhand funktioneller Reaktionen auf Markerverbindungen wie Adrenalin und Ghrelin identifiziert werden, die Veränderungen des zytosolischen Kalziums in einer bestimmten Population von Inselzellen induzieren. Dies kann einen Einblick in die Wechselwirkung zwischen dem Blutzucker und der Inselsekretionsausscheidung geben.

Protokoll

1. Laden Sie den Farbstoff oder drücken Sie den Sensor

aus

1. Bereite die fangbare Farbe vor.
   1. Das Aliquot (normalerweise 50 μg) des einfangbaren Farbstoffs (z. B. Fluo-4) wird in DMSO auf eine Stammkonzentration von 2 mM gelöst. Fügen Sie Pluronsäure bis zu einer Endkonzentration von 1 % hinzu (unter Verwendung eines Stammes von 20 % in DMSO), um die Solubilisierung des Farbstoffs zu verbessern.
   2. Aliquotieren Sie den Farbstoff in kleinen PCR-Röhrchen (jeweils 2 μl). Der Farbstoff kann gefroren (-20 °C) mehrere Wochen gelagert werden.
2. Alternativ können Sie den rekombinanten Sensor vorbereiten.
   1. Verteilen Sie den Sensor (z. B. adenovirale Vektoren, die GCaMP6f kodieren) in 10 μL Aliquots und lagern Sie ihn bei -80 °C.
   2. (Optional) können Sie den Titer des Virusstamms vorab testen, indem Sie Inselzellen (wie unten) mit mehreren seriellen Verdünnungen infizieren, um die optimale Konzentration für die Infektion zu ermitteln.
      Anmerkung: Rekombinante Sensoren, die von verschiedenen Vektoren (Lentivirus, BacMam, AAV) kodiert werden, erfordern ein anderes Infektionsprotokoll. Stellen Sie sicher, dass Sie dies mit dem Vektoranbieter überprüfen und das Arbeitsverhältnis für Ihre Bedürfnisse optimieren. Der "Arbeitsbestand" des Adenovirus kann bei -20 °C gelagert und mehrfach eingefroren/aufgetaut werden. Übermäßiger Frost-Tau-Zyklus reduziert den effektiven Titer des Virus.
3. Bereiten Sie die Imaging-Lösung vor.
   1. Stellen Sie die bildgebende Lösung mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7,4, mit NaOH).
   2. Bilden Sie einen Vorrat an Glukose (0,5 M) und Mannitol (0,5 M) in der bildgebenden Lösung. Die Brühe kann im Kühlschrank (4 °C) mehrere Wochen gelagert werden.
4. Lade den fangbaren Farbstoff.
   1. Stellen Sie die Farbstoffarbeitslösung her, indem Sie 2 μl des Farbstoffs in 600 μl der bildgebenden Lösung mit 6 mM Glukose auflösen. Die Lösung kann erhitzt oder verwirbelt werden, um die Solubilisierung zu verbessern.
   2. Laden Sie die isolierten Inseln in die Arbeitslösung des Farbstoffs. Die Beladung kann mit einer Multiwell-Platte oder einer Petrischale erfolgen. In letzterem Fall wird ein 100 μl großer Tropfen der Arbeitslösung auf den Boden einer nicht klebenden Petrischale (35 oder 60 mm) gegeben und 10-30 Inseln in den Tropfen pipettiert.
   3. Bei unterschiedlichen Inselgruppen (z. B. Wildtyp/Knock-out) sind mehrere Vertiefungen und mehrere Tröpfchen so anzuordnen, dass die Beladung gleichzeitig erfolgen kann.
   4. Inkubieren Sie die Inselzellen in der Färbelösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 70-90 Minuten. Nicht zu viel inkubieren.
   5. Überprüfen Sie die Beladung unter dem Fluoreszenzmikroskop; die Inselzellen sollten eine milde Fluoreszenz erhalten, wobei einige Zellen heller sind als die anderen. Das Aufrunden der Zellen und die Kernlokalisierung des Farbstoffs sind Anzeichen einer Überlastung.
   6. Übertragen Sie die Inselzellen in eine farbstofffreie Bildgebungslösung, die 6 mM Glukose enthält. Die Inselzellen können sofort für die Bildgebung verwendet werden, optional kann der Farbstoff jedoch weitere 10-15 Minuten entestert werden. Die Inselzellen behalten den Farbstoff für mehrere Stunden und können daher in mehreren Schichten für die Bildgebung verwendet werden.
5. Alternativ können Sie die Inseln mit dem rekombinanten Vektor infizieren.
   1. Die Inselzellen werden in Tröpfchen in RPMI-Kulturmedium (RMPI1640 (siehe Materialtabelle) eingelegt, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin. Geben Sie das Medium in zwei 60-mm-Petrischalen aus Kunststoff (nicht mit Klebstoff behandelt) und bewahren Sie die Schalen im Inkubator auf (37 °C, 5 % CO₂, absolute Luftfeuchtigkeit)). (z. B. 30 μL), um das benötigte Vektorvolumen zu minimieren.
   2. Fügen Sie den Vektor in einem Verhältnis von etwa 10⁵ infektiösen Einheiten/Insel hinzu, was idealerweise zu einer Vielzahl von Infektionen führen sollte >2. Im Idealfall sollte das Verhältnis auf das minimale Verhältnis optimiert werden, das in der peripheren Schicht Ausdruck verleiht. Eine Prätitration (Schritt 1.2.2) kann hilfreich sein.
   3. Geben Sie 20-50 Inselzellen in den Tropfen und kultivieren Sie sie 8-48 Stunden lang. (Idealerweise über Nacht). Die Inselzellen sollten in den meisten Zellen eine schwache grüne Fluoreszenz entwickeln, ohne dass sich die Zellmorphologie verändert.
      Anmerkung: Der Erfolg der Infektion und der Expression hängt von der Zeit der Exposition gegenüber der Viruslösung ab. Im Idealfall sollte das Virus über Nacht in der Lösung bleiben, kann aber optional bereits nach 15 Minuten entfernt werden. Die Infektiosität und damit die Expression ist jedoch wahrscheinlich dramatisch niedriger.

2. Bildgebung der Dynamik von Ca²⁺

1. Immobilisieren Sie die Inselzellen unter dem (inversen) Mikroskop.
   1. Bauen Sie die Bildgebungskammer für die inverse Mikroskopie zusammen. Positionieren Sie das Glasdeckglas (Dicke 1 oder 1,5) in der Kammer und stellen Sie sicher, dass die Glas-Kammer-Schnittstelle wasserdicht ist. Vergewissern Sie sich, dass sich das Deckglas in Reichweite des Mikroskopobjektivs befindet (kritisch für ein sperriges Objektiv mit hoher NA).
   2. Bereiten Sie das Immobilisierungszubehör vor. Schneiden Sie aus dem feinen Netz und dem groben Netz kleine Rechtecke (20 mm x 20 mm) aus. Führen Sie zwei Abstandshalter-"Wände" mit einem 45-50 μm dicken Klebeband auf das feine Netz ein. Verwenden Sie doppelte Schichten des Abstandhalters, wenn die Größe der abzubildenden Inselzellen die herkömmlichen 100 μm deutlich überschreitet.
   3. Tauchen Sie die Netze und das Gewicht mit einer 35-mm-Petrischale in die Bildgebungslösung. Stellen Sie sicher, dass der Kunststoff und das Metall nass sind.
   4. Drehen Sie unter einem Präpariermikroskop das feine Netz mit den Abstandshalter-"Wänden" auf den Kopf, die Abstandshalter zeigen nach oben. Nehmen Sie mehrere Inseln, die mit dem fangbaren Farbstoff beladen sind, oder drücken Sie den rekombinanten Sensor mit einer P20-Pipette aus und positionieren Sie sie vorsichtig auf dem feinen Netz zwischen den beiden Abstandshaltern. Stellen Sie sicher, dass das Netz und die Unterlegscheiben keine übermäßigen Mengen der Bildgebungslösung enthalten.
   5. Nehmen Sie das Netz mit den Inselzellen mit einer Uhrmacherzange auf und positionieren Sie es kopfüber in der Bildkammer, so dass die Abstandshalter nach unten zeigen und direkt auf dem Deckglas der Kammer sitzen. Achten Sie darauf, dass die Inselchen zwischen den Abstandshaltern und dem Netz in der Mitte des Deckglases eingeklemmt sind.
   6. Positionieren Sie das grobe Netz und das Gewicht auf dem feinen Netz innerhalb der Kammer. Führen Sie die Bildgebungslösung in die Kammer ein. Stellen Sie sicher, dass die Inselzellen immobilisiert und bereit für die Aufnahme sind. Vermeiden Sie übermäßiges Schütteln der Kammer (kleine Störungen wie das Tragen der Kammer zum Mikroskop und das Einsetzen in einen beheizten Tisch sind akzeptabel).
      Anmerkung: Eine ähnliche Immobilisierungsanordnung kann für ein aufrechtes System angewendet werden.
2. Richten Sie das Mikroskop ein.
   1. Wählen Sie den Bildgebungsmodus und das Objektiv, positionieren Sie die Kammer mit den Inseln aus Schritt 2.1 auf dem temperierten Tisch des Mikroskops.
      1. Stellen Sie die Temperaturregelung (idealerweise zwischen 30 °C und 36 °C) und die Perfusion ein. Positionieren Sie bei einem invertierten System den Zufluss tiefer als den Ausfluss in der Kammer und stellen Sie den Abflussfluss so ein, dass er größer ist als der des Zuflusses (was in der Regel durch die Verwendung eines Schlauchs mit einem breiteren Innendurchmesser an einer Schlauchpumpe erreicht wird).
      2. Stellen Sie sicher, dass der Ausfluss eine minimale Kontaktfläche mit der Lösung hat, so dass die Lösung in mehreren aufeinanderfolgenden kleinen Tröpfchen entfernt wird, wodurch lange Intervalle der kontinuierlichen Lösungsentfernung vermieden werden. Letzteres ist die Hauptquelle für Artefakte in der Zeitrafferabbildung der periodischen Signale, da sie als regelmäßige periodische Intensitätsschwingungen jedes abgebildeten Pixels erscheinen und häufig als "langsame Wellen" interpretiert werden.
      3. Initiieren Sie die Perfusion mit der bildgebenden Lösung, die 3 mM Glukose enthält.
   2. Wählen Sie den Strahlengang und die Filter für die Abbildung der grünen Fluorophore; Anregung zwischen 470 und 500 und Emission zwischen 505 und 550 würden für jeden von ihnen funktionieren.
   3. Führen Sie Live-Imaging aus, um die Imaging-Parameter einzurichten. Passen Sie die Ansicht an, um die interessanten Inseln zu erfassen.
   4. Optimieren Sie das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes. Passen Sie dazu die Intensität des Anregungslichts, die Belichtungszeit und das Binning an. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen eine eindeutige Visualisierung jeder Zelle innerhalb der Insel bei möglichst geringer Lichtintensität und Belichtung ermöglichen.
   5. Führen Sie die Bildaufnahme durch. Je nach Aufgabenstellung können Bilder mit 0,1 bis 5 Hz aufgenommen werden. Dies liegt deutlich unter den Nyquist-Kriterien für die schnellen Na⁺-getriebenen Oszillationen in α- und δ-Zellen (>300 Hz), was bedeutet, dass die Daten standardmäßig unterabgetastet werden. Eine Erhöhung der Erfassungsfrequenz, um dieser Nachfrage gerecht zu werden, ist jedoch bei der Bildgebung von Mehrzellern/Multiinseln mit einem großen Sichtfeld nicht möglich. GCaMP kann schneller abgebildet werden, während Fluo4 unter schnellen Aufnahmebedingungen unvermeidlich bleicht.
      Anmerkung: Angesichts der Tatsache, dass [Ca²⁺]cyt-Oszillationen in den Inselzellen durch elektrische Aktivität angetrieben werden, könnte die Verwendung niedriger Erfassungsraten kontraproduktiv erscheinen. In der Realität können jedoch Erfassungsraten von etwa oder über 1 Hz ausreichen, um das Spike-Verhalten von β Zellen aufzulösen, während die Schwelle für die Detektion von Natriumkanal-getriebenen Oszillationen in α- und δ-Zellen weit über 300 Hz liegt. Unabhängig davon, ob die α- oder δ-zelligen [Ca2⁺]_{cyt-Oszillationen} bei 1 Hz oder 0,1 Hz erfasst werden, werden sie stark unterabgetastet und spiegeln eher die Ca2⁺-Handhabung durch die Zelle als die elektrische Aktivität wider.
      1. Überprüfen Sie die Qualität der erfassten Daten: Bei 3 mM Glukose sollte die α-Zellaktivität deutlich sichtbar/nachweisbar sein. Stellen Sie sicher, dass dies der Fall ist, und fahren Sie mit der vollständigen Zeitrafferbildgebung fort.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40x/1,3 Objektiv
GCaMP6f, in einem adenoviralen Vektor (humaner Typ 5)	Vector Biolabs	1910
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	Nr. F7524-500ML
RPMI mittel	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Axiovert 200 Mikroskop
Fluo4	Thermo Fisher (Lebenstechnologien)	Nr. F14201