Primäre Isolierung von Azinuszellen: Eine Methode zur Isolierung von Azinuszellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Fleming Martinez, A. K., et al. Nachahmung und Manipulation der Pankreas-Azinus-zu-Duktus-Metaplasie in 3-dimensionaler Zellkultur. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik, die zur Isolierung von Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse verwendet wird - exokrine Zellen -, die eine Vielzahl von Verdauungsenzymen enthalten. Primäre Azinuszellen sind nützlich in der ex vivo-Studie der Azinus-zu-duktalen Metaplasie (ADM) - einem frühen Ereignis bei der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegekomitee und dem Jove Veterinary Review Board überprüft.

1. Isolierung von Azinuszellen

1. Opfern Sie die Maus durch CO_{2 -}Induktion und führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch. Präparieren Sie sofort die Bauchspeicheldrüse. Um die Bauchspeicheldrüse zu präparieren, stecken Sie zunächst die Pfoten der Maus an den Styropordeckel, richten Sie die Maus so aus, dass der Schwanz dem Forscher zugewandt ist, und besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol.
   Anmerkung: Bei der Maus, die in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wurde, handelte es sich um ein 12 Wochen altes nicht-transgenes Weibchen mit C57BL/6-Hintergrund. Die Mausauswahl wird im Diskussionsbereich näher erläutert.
   1. Heben Sie mit einer autoklavierten Schere und Pinzette das Fell/die Haut mit der Pinzette an der Mittellinie an und machen Sie mit der Schere einen Schnitt durch das Fell und die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Zwerchfell-/Brustkorbbereich.
   2. Machen Sie links und rechts zusätzliche Schnitte, so dass das Fell/die Haut abgeschnitten wird, um eine klare Sicht auf die Bauchhöhle zu schaffen. Schneiden Sie dann in die Bauchfellschleimhaut (in der Mitte und rechts und links) und ziehen Sie sie von den Organen weg, wie es mit dem Fell/der Haut gemacht wurde.
   3. Heben Sie den Darm mit der Pinzette an und legen Sie ihn auf die linke Seite der Maus, um Platz für die Bauchspeicheldrüse zu schaffen, die eine hellrosa Farbe hat, und befestigen Sie sie an der Milz, die ein dunkelrotes Oval ist. Das Bauchspeicheldrüsengewebe zeichnet sich durch seine weiche, schwammige Textur aus. Schneide die Bauchspeicheldrüse heraus, die entlang des Magens verläuft und sich mit dem Darm verflechtet.
   4. Trenne die Milz von der Bauchspeicheldrüse. Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse in ein 50 mL Röhrchen mit 10 mL HBSS mit 1x Penicillin-Streptomycin und bringen Sie dieses zur Laminar-Flow-Haube.
      Anmerkung: Die restlichen Schritte des Protokolls sollten unter Verwendung einer sterilen Technik in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
2. Gießen Sie die Bauchspeicheldrüse und HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) in eine leere Waage und waschen Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette, indem Sie sie schwenken. Bewegen Sie dann die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette zu einer zweiten Waage, die HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) enthält. Auch hier die Bauchspeicheldrüse durch Schwenken waschen.
3. Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse in das dritte HBSS (mit Penicillin-Streptomycin)-haltige Waagschiffchen und beginnen Sie, die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 5 mm oder weniger zu schneiden. Gießen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüsenstücke und HBSS in ein leeres 50-ml-Röhrchen.
   1. Bewegen Sie dazu mit der Pinzette die Bauchspeicheldrüsenstücke in die Flüssigkeit, während das Waagschach gekippt wird. Gießen Sie, sobald alle Teile nicht mehr an der Waage befestigt sind. Nehmen Sie alle restlichen Stücke mit der Pinzette auf und waschen Sie die Pinzette in dem 50-ml-Röhrchen, das die Bauchspeicheldrüse in HBSS enthält, mit Penicillin-Streptomycin.
4. Zentrifugieren Sie bei 931 x g für 2 min bei 4 °C und entfernen Sie dann das HBSS (und jegliches schwimmende Fett), indem Sie es mit einer 5-ml-Pipette abpipettieren.
5. Fügen Sie 5 ml Kollagenase hinzu (stellen Sie 40 ml HBSS + 5% FBS, 20 ml HBSS + 30% FBS und 5 ml 2 mg/ml Kollagenase in HBSS her. Die Kollagenase durch Filtration (0,22 μm Pore) sterilisieren und bei Raumtemperatur aufbewahren. Halten Sie jede der HBSS-Lösungen auf Eis) zur Bauchspeicheldrüse. Stellen Sie sicher, dass der Deckel verschlossen ist, indem Sie das 50-ml-Röhrchen in Plastikparaffinfolie einwickeln und dann in einen Inkubator legen und bei 220 U/min bei 37 °C schütteln.
   Anmerkung: Die Verdauungszeit der Kollagenase kann variieren, wie in der Diskussion erwähnt. Am Ende der Inkubation sollten keine großen Gewebestücke mehr übrig bleiben.
6. Um die Dissoziation zu stoppen, legen Sie den pankreashaltigen Schlauch auf Eis und fügen Sie 5 ml kaltes HBSS + 5% FBS hinzu. Bei 931 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand mit einer 5-ml-Pipette abpipettieren.
In
7. 10 mL HBSS + 5 % FBS resuspendieren und bei 931 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit einer 5 mL Pipette abpipettieren und diesen Schritt mit weiteren 10 mL HBSS + 5 % FBS wiederholen.
8. Resuspendieren Sie in 5 mL HBSS + 5 % FBS und überführen Sie mit einem P1000 jeweils 1 mL durch ein 500-μm-Netz in ein 50-ml-Röhrchen. Geben Sie weitere 5 ml HBSS + 5 % FBS mit einem P1000 durch das Netz, um alle verbleibenden Pankreaszellen durch das Netz zu spülen.
9. Geben Sie die Zellsuspension aus dem 500-μm-Netz durch das 105-μm-Netz, indem Sie jeweils 1 ml mit einem P1000 pipettieren. Pipettieren Sie anschließend die Zellsuspension vorsichtig in ein Röhrchen, das HBSS + 30 % FBS enthält. Oben bildet sich eine Schicht aus Zellsuspension; Nach der Zentrifugation sinken die Azinuszellen zu einem Pellet ab.
10. Zentrifugieren Sie bei 233 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1x Waymouth's vollständigem Medium.
    1. Wenn Sie direkt zur Einbettung von Zellen in die Kollagen- oder Basalmembranmatrix übergehen, resuspendieren Sie in einem Volumen von 7 ml pro Bauchspeicheldrüse. Wenn Sie zu einer adenoviralen oder lentiviralen Infektion übergehen, resuspendieren Sie in 4 ml pro Bauchspeicheldrüse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
37 °C Schüttelinkubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Inkubator	NUAIRE	NU-5500
50 ml Röhrchen	Falke	Artikel-Nr.: 352070
Saugeinlage, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
BD Präzisions-Gleitnadel 21G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Verwendung als Stifte zum Sezieren
Becherglas, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Zentrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Zentrifuge
Kollagenase Typ I, Clostridium histolyticum	Sigma	Nr. C0130-1G	Stellen Sie eine Lösung von 100 mg/ml her, indem Sie das Pulver in sterilem Wasser für die Molekularbiologie auflösen. Beim Auftauen eines Aliquots auf 10 mg/ml verdünnen, filtrieren, sterilisieren und 1 ml Aliquote bei -20 °C auffüllen.
Dexamethason	Sigma	Nr. D1756	Eine Lösung von 4 mg/ml herstellen, indem Pulver in Methanol gelöst, aliquotiert und bei -20 °C gelagert wird.
Ethanol, 200 Proof	Decon Laboratorien	Nr. 2701
Fötales Rinderserum	Sigma	F0926-100mL
Zange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 11002-12
Zange	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Artikel-Nr.: 91127-12
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot	Fisher Scientific	SH3048801
Eiskübel, rechteckig	Fisher Scientific	Tel.: 07-210-103
LAB GUARD Probenbeutel (für Maus nach der Dissektion)	Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	PM992	Im Manuskript als "Kunststoff-Paraffinfilm" bezeichnet
Pbs	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipettenspitzen, 10 μl	USA Wissenschaftlich	Tel.: 1110-3700
Pipettenspitzen, 1000 μl	Olympus Kunststoffe	24-165RL
Pipettenspitzen, 200 μl	USA Wissenschaftlich	Nr. 1111-1700
Pipet-Hilfe	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipetten, 10 ml	Falke	357551
Pipetten, 25 ml	Falke	357525
Pipetten, 5 ml	Falke	357543
Polypropylen-Gewebe, 105 μm	Spectrum Labore	146436
Polypropylen-Gewebe, 500 μm	Spectrum Labore	146418
Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14568-12
Schere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 14568-13
Natriumbicarbonat (feines weißes Pulver)	Fisher Scientific	Nr. BP328-500
Natriumhydroxid	Fisher Scientific	Nr. S318-500
Sojabohnen-Trypsin-Hemmer	Gibco	17075029
Spatel	Fisherbrand	Artikel-Nr.: 21-401-10
Steriflip 50 ml, 0,22 Mikron Filter	Millipore	SCGP00525
Typ I Rattenschwanz-Kollagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (Pulver)	Sigma	W1625-10X1L
Wägeschiffchen, sechseckig, mittel	Fisherbrand	Tel.: 02-202-101