Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung von Materialien, Lösungen und 3-dimensionalen Matrixbasen
- Schneiden Sie 500 μm und 105 μm Polypropylen-Maschen in 76 mm x 76 mm große Quadrate. Falten Sie jedes Quadrat zweimal in der Mitte, um ein kleineres gefaltetes Quadrat zu erhalten. Legen Sie ein 500-μm- und ein 105-μm-Maschenquadrat in einen autoklavierbaren Beutel.
- Autoklavieren Sie Quadrate aus Polypropylennetz sowie zwei Paar Scheren und Pinzetten.
- Stellen Sie 100 ml 10x Waymouth's Lösung her. Rühren Sie 1 Fläschchen (14 g) Waymouth-Pulver in 50 mL deionisiertes (DI) Wasser ein und fügen Sie, wenn es aufgelöst ist, 30 mL 7,5 % (75 g/l) Natriumbicarbonat hinzu. Bringen Sie das Endvolumen mit DI-Wasser auf 100 mL und sterilisieren Sie den Filter.
- Lagern Sie 10x Waymouth's Medien bei 4 °C und verwenden Sie sie zur Herstellung von Kollagengelen und 1x Waymouth's Medien. Wenn sich Ausfällungen bilden, verwerfen.
- Stellen Sie 50 ml 1x Waymouths vollständiges Medium pro Bauchspeicheldrüse her, indem Sie 125 μl 40 mg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, 12,5 μl 4 mg/ml Dexamethason und 500 μl fötales Rinderserum (FBS) hinzufügen. Durch Filtration sterilisieren und innerhalb von 48 h verbrauchen.
- Bereiten Sie 3-dimensionale Matrixbasen entweder mit Kollagen- oder Basalmembranmatrix vor (Produktinformationen finden Sie in der Materialtabelle). Legen Sie die Platte beim Pipettieren der Basis auf Eis, vermeiden Sie Blasen und drehen Sie die Platte unmittelbar nach dem Pipettieren des Volumens jeder Vertiefung, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten.
- Stellen Sie Kollagenbasen her, indem Sie die folgenden Komponenten auf Eis in einer Gewebekulturhaube mischen: 5,5 ml Rattenschwanzkollagen vom Typ I, 550 μl 10x Waymouth's Media und 366,6 μl 0,34 M NaOH (gefiltert).
HINWEIS: Dies ist eine ausreichende Lösung, um Kollagenbasen für eine 24-Well-, 12-Well- oder 6-Well-Platte herzustellen. Eine Platte ist ausreichend für die Azinusisolierung aus einer Bauchspeicheldrüse.
- Verwenden Sie die folgenden Volumina, um die Kollagenbasis zu plattieren: 80 μl (8-Well-Glasobjektträger), 200 μl (24-Well-Platte), 400 μl (12-Well-Platte) oder 800 μl (6-Well-Platte).
- Für die Basalmembran-Matrix-Basen pipettieren Sie die Matrix ohne zusätzliche Komponenten. Verwenden Sie die folgenden Volumina für jede Vertiefung: 50 μl (8-Well-Glasobjektträger), 120 μl (24-Well-Platte), 240 μl (12-Well-Platte) oder 600 μl (6-Well-Platte).
- Lassen Sie die Basen mindestens 30 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) erstarren, bevor Sie eine zweite Matrixschicht mit eingebetteten Zellen auf diesen Basen erstellen.
- Bewahren Sie zur Vorbereitung auf die Azinusisolierung ein 600-ml-Becherglas, drei 50-ml-Röhrchen, eine autoklavierte Schere, eine autoklavierte Pinzette und einen Eiskübel unter der Haube mit drei Wiegeschiffchen auf. Stellen Sie dann 30 ml HBSS mit 300 μl 100x Penicillin-Streptomycin her, geben Sie jeweils 10 ml in zwei Waagschalen und bewahren Sie die restlichen 10 ml in einem 50-ml-Röhrchen auf (zur Verwendung in den Schritten 1.8.2 und 2.1.4).
- Stellen Sie 40 ml HBSS + 5% FBS, 20 ml HBSS + 30% FBS und 5 ml 2 mg/ml-Kollagenase in HBSS her. Die Kollagenase durch Filtration (0,22 μm Pore) sterilisieren und bei Raumtemperatur aufbewahren. Bewahren Sie jede der HBSS-Lösungen auf Eis auf.
- Richten Sie einen Arbeitsbereich für die Pankreasdissektion ein, die auf einem Labortisch durchgeführt werden kann.
- Lege ein saugfähiges Pad auf den Tisch, zusammen mit einem mit Folie bedeckten Styropordeckel. Lege dann ein Papiertuch mit 4 Stecknadeln auf die Folie.
- Halten Sie die folgenden Gegenstände in Reichweite des Sezierarbeitsbereichs: einen Verbrennungsbeutel, eine Autoklavierschere und eine Pinzette, eine Sprühflasche mit 70 % Ethanol und einen Eiskübel (mit dem 50-ml-Röhrchen HBSS, das Penicillin-Streptomycin aus Schritt 1.6 enthält).
- Eine Zentrifuge auf 4 °C und einen Shaker auf 37 °C stellen.
2. Isolierung von Azinuszellen
- Opfern Sie die Maus durch CO2 -Induktion und führen Sie eine Gebärmutterhalsluxation durch. Präparieren Sie sofort die Bauchspeicheldrüse. Um die Bauchspeicheldrüse zu präparieren, stecken Sie zunächst die Pfoten der Maus an den Styropordeckel, richten Sie die Maus so aus, dass der Schwanz dem Forscher zugewandt ist, und besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol.
HINWEIS: Bei der Maus, die in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wurde, handelte es sich um eine 12 Wochen alte, nicht transgene Hündin mit C57BL/6-Hintergrund. Die Mausauswahl wird im Diskussionsbereich näher erläutert.
- Heben Sie mit einer autoklavierten Schere und Pinzette das Fell/die Haut mit der Pinzette an der Mittellinie an und machen Sie mit der Schere einen Schnitt durch das Fell und die Haut von der Harnröhrenöffnung bis zum Zwerchfell-/Brustkorbbereich.
- Machen Sie links und rechts zusätzliche Schnitte, so dass das Fell/die Haut abgeschnitten wird, um eine klare Sicht auf die Bauchhöhle zu schaffen. Schneiden Sie dann in die Bauchfellschleimhaut (in der Mitte und rechts und links) und ziehen Sie sie von den Organen weg, wie es mit dem Fell/der Haut gemacht wurde.
- Heben Sie den Darm mit der Pinzette an und legen Sie ihn auf die linke Seite der Maus, um Platz für die Bauchspeicheldrüse zu schaffen, die eine hellrosa Farbe hat, und befestigen Sie sie an der Milz, die ein dunkelrotes Oval ist. Das Bauchspeicheldrüsengewebe zeichnet sich durch seine weiche, schwammige Textur aus. Schneide die Bauchspeicheldrüse heraus, die entlang des Magens verläuft und sich mit dem Darm verflechtet.
- Trenne die Milz von der Bauchspeicheldrüse. Legen Sie dann die Bauchspeicheldrüse in ein 50 mL Röhrchen mit 10 mL HBSS mit 1x Penicillin-Streptomycin und bringen Sie dieses zur Laminar-Flow-Haube.
Anmerkung: Die restlichen Schritte des Protokolls sollten unter Verwendung einer sterilen Technik in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.
- Gießen Sie die Bauchspeicheldrüse und HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) in eine leere Waage und waschen Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette, indem Sie sie schwenken. Bewegen Sie dann die Bauchspeicheldrüse mit der Pinzette zu einer zweiten Waage, die HBSS (mit Penicillin-Streptomycin) enthält. Auch hier die Bauchspeicheldrüse durch Schwenken waschen.
- Bewegen Sie die Bauchspeicheldrüse in das dritte HBSS (mit Penicillin-Streptomycin)-haltige Waagschiffchen und beginnen Sie, die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 5 mm oder weniger zu schneiden. Gießen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüsenstücke und HBSS in ein leeres 50-ml-Röhrchen.
- Bewegen Sie dazu mit der Pinzette die Bauchspeicheldrüsenstücke in die Flüssigkeit, während das Waagschach gekippt wird. Gießen Sie, sobald alle Teile nicht mehr an der Waage befestigt sind. Nehmen Sie alle restlichen Stücke mit der Pinzette auf und waschen Sie die Pinzette in dem 50-ml-Röhrchen, das die Bauchspeicheldrüse in HBSS enthält, mit Penicillin-Streptomycin.
- Zentrifugieren Sie bei 931 x g für 2 min bei 4 °C und entfernen Sie dann das HBSS (und jegliches schwimmende Fett), indem Sie es mit einer 5-ml-Pipette abpipettieren.
- Geben Sie 5 ml Kollagenase (in Schritt 1.7 in HBSS verdünnt) in die Bauchspeicheldrüse. Stellen Sie sicher, dass der Deckel verschlossen ist, indem Sie das 50-ml-Röhrchen in Plastikparaffinfolie einwickeln und dann in einen Inkubator legen und bei 220 U/min bei 37 °C schütteln.
HINWEIS: Die Verdauungszeit der Kollagenase kann variieren, wie in der Diskussion erwähnt. Am Ende der Inkubation sollten keine großen Gewebestücke mehr übrig bleiben.
- Um die Dissoziation zu stoppen, legen Sie den pankreashaltigen Schlauch auf Eis und fügen Sie 5 ml kaltes HBSS + 5% FBS hinzu. Bei 931 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand mit einer 5-ml-Pipette abpipettieren.
In - 10 mL HBSS + 5 % FBS resuspendieren und bei 931 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand mit einer 5 mL Pipette abpipettieren und diesen Schritt mit weiteren 10 mL HBSS + 5 % FBS wiederholen.
- Resuspendieren Sie in 5 mL HBSS + 5 % FBS und überführen Sie mit einem P1000 jeweils 1 mL durch ein 500-μm-Netz in ein 50-ml-Röhrchen. Geben Sie weitere 5 ml HBSS + 5 % FBS mit einem P1000 durch das Netz, um alle verbleibenden Pankreaszellen durch das Netz zu spülen.
- Geben Sie die Zellsuspension aus dem 500-μm-Netz durch das 105-μm-Netz, indem Sie jeweils 1 ml mit einem P1000 pipettieren. Pipettieren Sie anschließend die Zellsuspension vorsichtig in ein Röhrchen, das HBSS + 30 % FBS enthält. Oben bildet sich eine Schicht aus Zellsuspension; Nach der Zentrifugation sinken die Azinuszellen zu einem Pellet ab.
- Zentrifugieren Sie bei 233 x g für 2 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1x Waymouth's vollständigem Medium.
- Wenn Sie direkt zur Einbettung von Zellen in die Kollagen- oder Basalmembranmatrix übergehen, resuspendieren Sie in einem Volumen von 7 ml pro Bauchspeicheldrüse. Wenn Sie zu einer adenoviralen oder lentiviralen Infektion übergehen, resuspendieren Sie in 4 ml pro Bauchspeicheldrüse.
3. Virusinfektion
- Da eine Bauchspeicheldrüse für zwei Virusinfektionen (Kontroll- und experimentelle, z. B. null und cre) ausreicht, teilen Sie die Zellsuspension auf die Deckel von zwei 35-mm-Platten auf. Die Verwendung des Deckels der Platten ermöglicht eine Infektion in Suspension und somit ein leichtes späteres Verschieben auf das endgültige Substrat.
- Wenn Sie mit Viren arbeiten, weichen Sie alle gebrauchten Pipettenspitzen mindestens 15 Minuten lang in 10 % Bleiche ein.
Anmerkung: Die Verwendung der 35-mm-Platten und des 4-ml-Volumens eignet sich gut für Zellen von nicht-transgenen Mäusen im Alter zwischen 8 und 16 Wochen. Bei Tieren mit kleinerer oder größerer Bauchspeicheldrüse muss möglicherweise die Plattengröße und das Plattenvolumen angepasst werden.
- Bei adenoviralen Infektionen das Virus (mit einem Titer von mindestens 107 TU/ml) in einer Verdünnung von 1:1.000 auf den Deckel jeder Platte geben und schwenken (Abbildung 1, GFP-Adenovirus). Legen Sie die Platten in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) und schwenken Sie sie alle 15 Minuten für 1 h. Die Inkubation für weitere 2 Stunden fortsetzen und dann mit der Einbettung der Zellen in die Kollagen- oder Basalmembranmatrix fortfahren.
Nachdem Sie die - Virusarbeit in der Haube abgeschlossen haben, tränken Sie alle Bestandteile in der Haube mindestens 15 Minuten lang mit 10 % Bleiche und reinigen Sie das Bleichmittel dann gründlich mit 70 % Ethanol
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4. Einbettung von Zellen in Kollagen- oder Basalmembranmatrix
- Stellen Sie Kollagengel auf Eis her, indem Sie 7 ml Typ-I-Rattenschwanzkollagen (3,3 mg/ml), 700 μl des 10-fachen Waymouth-Mediums und 466,6 μl 0,34 M NaOH kombinieren.
- Nehmen Sie gleiche Mengen Kollagengel und Zellsuspension und mischen Sie vorsichtig. Wenn Sie einen Reiz oder Inhibitor hinzufügen, kombinieren Sie diesen mit der Kollagen-Zell-Suspension. Eine Vertiefung nach der anderen anrichten (Platten aus Schritt 1.5.3); Halten Sie die Platte auf Eis und schwenken Sie, um die Kollagen-Zellschicht gleichmäßig zu verteilen.
- Pipettieren Sie in jeder Vertiefung die folgenden Volumina der Kollagenzellsuspension: 200 μl (8-Well-Glasobjektträger), 500 μl (24-Well-Platte), 1000 μl (12-Well-Platte) oder 2000 μl (6-Well-Platte). Es ist zu beachten, dass ADM durch Stimulation mit TGF-α (50 ng/ml) in Abbildung 1 induziert wird.
- Für die Einbettung von Zellen in die Basalmembranmatrix mischen Sie die einteilige Basalmembranmatrix mit der zweiteiligen Zellsuspension. Halten Sie wie bei Kollagen sowohl die Matrix-Zell-Suspension als auch die Platte auf Eis. Pipettieren Sie jeweils vertieft mit den gleichen Volumina wie in 4.2.1 und schwenken Sie sie für eine gleichmäßige Verteilung.
- Legen Sie die Platte für 30 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2), um sich zu verfestigen, und fügen Sie dann 1x Waymouths vollständiges Medium mit einem beliebigen Stimulus oder Inhibitor hinzu (Abbildung 1 verwendet TGF-α bei 50 ng/ml). Wechseln Sie das Medium (mit Reiz oder Inhibitor) am nächsten Tag und dann jeden zweiten Tag. Je nach Stimulus kann ADM zwischen Tag 3 und Tag 5 beobachtet werden.
