Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Zusammenfassung

Quelle: Villarreal D. et al. Ein einfaches hocheffizientes Protokoll für die Isolierung von Pankreasinseln aus Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

Die benötigten chirurgischen Werkzeuge sind in Abbildung 1 dargestellt und das schematische Diagramm des Verfahrens ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Lösungen

1. Bereiten Sie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zu, indem Sie 100 mL 10X HBSS (ab Lager) zu 900 mL destilliertem Wasser hinzufügen, um 1 L HBSS (1X) herzustellen.
2. Bereiten Sie die STOP-Lösung vor (muss frisch zubereitet werden und soll....

Ergebnisse

Abbildung 1: Chirurgische Instrumente.
Gezeigt werden gebogene chirurgische Scheren, Deckglaszangen, Mikro-Adson-Pinzetten, gebogene Pinzetten, kleine chirurgische Scheren und Schwartz-Mikroserraffinen (mikrovaskuläre Klemme). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Ab.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3 mL Spritze	Bd	309657	Halten der Kollagenase P
Zange aus Deckglas	VWR	Tel.: 82027-396	Halten der Haut der Maus, um den Schnitt zu erleichtern
Gebogene Pinzette	Sigma-Aldrich	Z168696	Halten von Gewebe während der Entnahme der Bauchspeicheldrüse
100 mm Petrischalen	VWR	Nr. 30-2041	Wird für die Inselkultur verwendet
30 G. 1/2 Zoll Nadel	Bd	305106	Für die Penetration von Ampulla des Vaters, um Kollagenase P zu liefern - wird dieses Maß verwendet, da es gut in die meisten CBDs passt
50ml Tube	VWR	Tel.: 89039-658	Enthält verdautes Pankreasgewebe, Kollagenase P und gereinigte Inselzellen
Saugeinlagen mit wasserdichtem Feuchtigkeitssperre	VWR	Artikel-Nr.: 82020-845	Zur Aufnahme von Blut aus chirurgischen Eingriffen
Zentrifuge 5810R mit Swing Schaufel- und Verzögerungsfähigkeit	Eppendorf	Artikel-Nr.: 5811FJ478114	Zur Pelletierung von Geweben wird das Pellet am Boden des konischen Rohrs gebildet - eine Schwenkschaufelzentrifuge ist erforderlich. Auch die Deklarationsfunktion ist wichtig, um die Verlaufsschichten zu bilden
Kollagenase P- 1g	Roche Diagnostik	11249002001	Zur Verdauung der exokrinen Bauchspeicheldrüse
Gebogene chirurgische Schere	Fischer-Wissenschaftlich	Artikel-Nr.: 13-804-21	Zum Aufschneiden des Bauches von Mäusen
Mikroskop zum Sezieren	Olymp	SZX16	Wird zur Identifizierung wichtiger anatomischer Strukturen verwendet, um genau Kollagenase in die Bauchspeicheldrüse abgeben
Hank's Ausgewogene Salzlösung 10x	Corning	20-023-CV	Waschzellen
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	Zur Gradientenbildung
Lichtquelle	Leeds	LR92240	Verbesserung der Sichtbarkeit des Mikroskops
RPMI-1640 Medien ohne L-Glutamin	Corning	15-040-CV	Kultivierung von Inselchen
Schwartz Mikro-Serraffinate (Mikrovaskuläre Klemme)	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 18052-01	Klemmen des gemeinsamen Gallengangs und Leberarterie
Schüttelndes Wasserbad	Boekel/Grant	Artikel-Nr.: 8R0534008	Wichtig für die mechanische Verdauung von exokrinen Geweben
Kleine chirurgische Schere	VWR	Tel.: 82027-578	Schneiden von Gewebe, das an der Bauchspeicheldrüse befestigt ist
RNaseZap	Fischer-Wissenschaftlich	AM9780	Zum Entfernen von RNase
Isofluran	Piramal	B13B16A	Zur Betäubung von Mäusen vor einer Operation