$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Die benötigten chirurgischen Werkzeuge sind in Abbildung 1 dargestellt und das schematische Diagramm des Verfahrens ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Lösungen
- Bereiten Sie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zu, indem Sie 100 mL 10X HBSS (ab Lager) zu 900 mL destilliertem Wasser hinzufügen, um 1 L HBSS (1X) herzustellen.
- Bereiten Sie die STOP-Lösung vor (muss frisch zubereitet werden und sollte innerhalb von 1 h verwendet werden), indem Sie 50 ml 100x fötales Rinderserum (FBS) zu 450 ml eiskaltem 1x HBSS hinzufügen; dies ergibt 500 ml STOP-Lösung. Halten Sie die STOP-Lösung bei 4 °C.
- Bereiten Sie die Kollagenase P-Lösung vor (muss innerhalb von 1 h nach der Anwendung frisch gemacht werden), indem Sie 1 mg/ml Kollagenase P zu eiskaltem 1X HBSS hinzufügen; verwenden Sie 6 ml/Maus.
- Fügen Sie 0,05 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) zur Kollagenase-P-Lösung hinzu (dies versorgt die isolierten Inseln mit Nährstoffen). Verwenden Sie zum Beispiel 3 mg BSA in 6 ml Kollagenase P-Lösung.
- Berechnen und bereiten Sie die Menge an Kollagenase P vor, die für alle Mäuse in einem 50-ml-Röhrchen benötigt wird.
- Bereiten Sie das komplette RPMI 1640-Medium vor, indem Sie 10 % FBS, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, INS-1-Zellergänzungsmittel (10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol) zu 500 mL RPMI 1640 Medium mit 5,5 mM Glukose hinzufügen, das für die Übernachtkultur und Inkubation verwendet wird.
2. Vorbereitung
- Füllen Sie drei 50-ml-Röhrchen mit 25 mL RNase-hemmender Lösung, 70 % Ethanol oder destilliertem H2O. Diese Lösungen werden für die Reinigung von chirurgischen Instrumenten vor und während des Eingriffs verwendet.
- Weichen Sie die Spitzen der Werkzeuge 30 Minuten lang in RNase-hemmender Lösung ein, bevor Sie das Protokoll starten. Dadurch wird jegliche potenzielle RNase auf den Werkzeugen eliminiert.
- Vorgeschnittene saugfähige Pads mit einer Größe von 6 Zoll x 6 für den Einsatz während der Operation.
- 1X HBSS-Lösung im Voraus zubereiten und bei 4 °C lagern. STOP-Lösung vor der Operation vorbereiten. Bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie die Kollagenase P-Lösung unmittelbar vor der Operation vor und lagern Sie sie auf Eis.
Anmerkung: Dies sollte innerhalb von 2 Stunden nach der Zubereitung verwendet werden.
- Etikettieren Sie 50-ml-Röhrchen für den Aufschluss und die Reinigung; bereiten Sie 2 Röhrchen für jede Maus vor, eines für den Aufschluss und das andere für die Reinigung der Inselzellen. Stellen Sie sicher, dass sich die Tier-ID auf beiden Röhrchen befindet.
- Geben Sie 3 ml Kollagenase P-Lösung in das erste 50-ml-Röhrchen. Die restlichen 3 ml Kollagenase P werden injiziert.
- Ziehen Sie die restlichen 3 ml Kollagenaselösung in eine 3 ml-Spritze, die mit einer Nadel von 30 G 1/2 in der Nadel montiert ist. Legen Sie die Spritze auf Eis.
3. Vorgehensweise
- Entfernen Sie alle Werkzeuge aus der RNase-hemmenden Lösung, tauchen Sie sie dann zuerst in das Röhrchen mit 70 % Ethanol, dann in das Röhrchen mit destilliertem H2O und trocknen Sie es dann an der Luft auf einem sauberen Papiertuch.
- Legen Sie die Maus in eine Kammer mit 0,5 ml Isofluran, bis die Maus tief betäubt ist.
- Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und überprüfen Sie den Narkosezustand, indem Sie ein Fußpolster mit einer Pinzette einklemmen. Die Tiefenanästhesie basiert auf der Beobachtung, dass die Atmung stetig langsamer wird und die Maus nicht auf das Einklemmen des Fußes reagiert. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Maus tief betäubt ist, euthanasieren Sie die Maus mit Gebärmutterhalsluxation und legen Sie die Maus dann auf das saugfähige Pad.
- Legen Sie die betäubte Maus auf den Bauch, üben Sie Druck auf den Hals aus und verrenken Sie die Wirbelsäule vom Gehirn durch Ziehen am Schwanz.
- Kleben Sie die Gliedmaßen der Maus in Rückenlage auf das saugfähige Pad, besprühen Sie den Körper mit 70 % Ethanol und wischen Sie überschüssiges Ethanol ab.
- Verwenden Sie eine Zange aus Deckglas und eine gebogene chirurgische Schere, um Schnitte vorzunehmen. Machen Sie zuerst einen horizontalen Schnitt auf der Haut des Bauchbereichs (~3 cm), ziehen Sie die Haut weit auf, um die Bauchdecke freizulegen. Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt (~3–4 cm) am Bauchfell, um die Bauchspeicheldrüse in der Bauchhöhle vollständig freizulegen (Abbildung 3).
- Schieben Sie die Leberlappen nach oben, um den Gallengang freizulegen, er erscheint als blassrosa Röhre (Abbildung 3).
- Bewegen Sie den Darm vorsichtig von der rechten Lenden-/Beckenregion der Bauchhöhle nach rechts, wobei Sie den Gallengang und die Leberarterie freilegen (Abbildung 3).
- Klemmen Sie den Gallengang vorsichtig mit den Schwartz-Mikroserraffinen (Abbildung 1) so nah wie möglich an der Leber ab.
- Identifizieren Sie die Ampulle von Vater, die sich an der Zwölffingerdarmpapille befindet, die durch die Vereinigung des Pankreasgangs und des gemeinsamen Gallengangs gebildet wird. Die Ampulle von Vater erscheint geschwollen, wenn man sie unter dem Präpariermikroskop betrachtet, das den Zugang zum Gallengang communis bildet (Abbildung 4).
Anmerkung: Die Einstellung der Intensität/des Lichtwinkels des Dissektionsmikroskops kann die Ortung erleichtern.
- Führen Sie die Spritze mit 3 mL der Kollagenase P-Lösung in die Ampulle von Vater ein. Schieben Sie die Nadel etwa 1/4 der Länge des gemeinsamen Gallengangs in den Gang (Ampulle führt in den Ductus), wie in Abbildung 5 gezeigt.
- Sobald sich die Nadel in der Ampulle befindet, stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung der Nadel so ist, dass sie parallel zum Kanal ist.
- Stabilisieren Sie die Nadel, indem Sie sie mit einer Mikro-Adson-Pinzette klemmen, um zu verhindern, dass sie den Kanal durchsticht (Abbildung 5).
- Injizieren Sie langsam und stetig 3 ml der Kollagenase P-Lösung aus der Spritze in den gemeinsamen Gallengang (genug, um einen Widerstand zu spüren), wie in Abbildung 6 gezeigt. Ziel ist es, einen Rückflussdruck zu erzeugen, um die Kollagenase in den Pankreasgang zu zwingen. Die Injektion gilt als erfolgreich, wenn Kopf, Hals, Körper und Schwanz der Bauchspeicheldrüse vollständig aufgebläht sind.
Anmerkung: Die Inselausbeute ist gering, wenn entweder die Bauchspeicheldrüse nicht vollständig aufgebläht ist oder die Milzfläche nicht vollständig aufgebläht ist. Der Milzbereich enthält die höchste Anzahl von Inselchen6. Das Aufblasen kann durch das Auftreten von offenen Räumen zwischen dem Pankreasgewebe bestätigt werden, die mit Lösung gefüllt sind.
- Präparieren Sie die aufgeblähte Bauchspeicheldrüse vorsichtig und legen Sie sie in ein 50-ml-Verdauungsröhrchen mit 3 ml eiskalter Kollagenase-P-Lösung.
- Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse mit 2 Pinzetten (gebogen und Micro Adson; Siehe Abbildung 1): (Von der Milz ausgehend die Bauchspeicheldrüse von der Milz wegziehen und weiter aus dem Magen und entlang des Zwölffingerdarms entfernen.
Anmerkung: Keine Schnitte erforderlich.
- Die Bauchspeicheldrüse wird im Verdauungsröhrchen 3–5 s lang mit 3 ml eiskalter Kollagenase P-Lösung mit einer feinen chirurgischen Schere gehackt (Abbildung 7A).
- Befestigen Sie den Schlauch auf einem Gestell im 37 °C warmen Wasserbad und schütteln Sie ihn bei 100–120 U/min für ca. 12–13 Minuten.
- Schütteln Sie die Röhrchen nach der Inkubation vorsichtig mit der Hand, um das Gewebe zu zerkleinern, bis die Kollagenase-P-Aufschlusslösung homogen wird (Abbildung 7B). Die Homogenität wird durch ein sandartiges Aussehen der feinen Partikel der Bauchspeicheldrüse bestätigt. Etwa 30 s sanftes Händeschütteln reichen in der Regel aus. Halten Sie das Röhrchen gegen Licht, um zu untersuchen, ob das Gewebe gut homogenisiert ist. Bei Bedarf weitere ~15 s schütteln.
- Nach der Verdauung legen Sie die Röhrchen sofort auf Eis und fügen Sie 40 ml eiskalte STOP-Lösung hinzu, um den enzymatischen Aufschluss zu beenden.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Aufschlussröhrchen bis zu 2 Stunden auf Eis belassen werden, wenn an mehreren Mäusen gearbeitet wird.
- Das Röhrchen wird in einer Schwingschaufelzentrifuge bei 300 x g für 30 s zentrifugiert (die Temperatur der Zentrifuge ist flexibel).
Anmerkung: Verwenden Sie eine Schwingzentrifuge so, dass sich das Gewebepellet am Boden des 50-ml-Röhrchens und nicht an der Wand des Röhrchens bildet. Dies ist entscheidend für eine bessere Inselausbeute.
- Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit der STOP-Lösung noch 2 Mal, wobei Sie die Lösung nach jedem Schleudern dekantieren. Verwenden Sie 20 ml STOP-Lösung für jede weitere Wäsche.
- Brechen Sie das Pellet vor jedem Schleudern auf, indem Sie das Gewebepellet im 50-ml-Röhrchen in 20 mL STOP-Lösung vorsichtig schütteln.
- Das Gewebepellet erneut mit 40 mL eiskaltem HBSS suspendieren und bei 300 x g für 30 s zentrifugieren.
- Dekantieren und wiederholen Sie die Zentrifugation mit einer Schwingschaufelzentrifuge mit HBSS-Lösung noch zwei weitere Male, wobei die Lösung nach jedem Schleudern dekantiert wird. Verwenden Sie 20 ml HBSS für jede Wäsche.
- Brechen Sie vor jedem Schleudern das Pellet auf, um es vom Boden des Röhrchens zu lösen, indem Sie das Röhrchen mit 20 mL HBSS-Lösung vorsichtig schütteln.
- Nach der letzten Zentrifugation alle HBSS entfernen.
- Geben Sie dann 5 ml Dichtegradient bei Raumtemperatur in das 50-ml-Röhrchen mit dem Pellet. Bei niedriger Geschwindigkeit kurz vortexen, bis sie homogenisiert sind.
- Geben Sie weitere 5 mL des Dichtegradienten bei Raumtemperatur in das 50 mL Röhrchen. Nicht vortexen/mischen.
Anmerkung: Es ist wichtig, gleichmäßig und ruhig zu bleiben, damit sich ein besseres Gefälle ohne Unterbrechung bilden kann.
- Pipettieren Sie 10 ml HBSS-Puffer bei Raumtemperatur in das Röhrchen (mit dem Dichtegradienten) Tropfen für Tropfen vorsichtig und langsam, damit sich ein Gradient bilden kann. Verwenden Sie eine Pipettenpistole mit einer 10-ml-Pipette, um HBSS tropfenweise hinzuzufügen.
- Mit einer Schwingschaufelzentrifuge die Röhrchen 15 Minuten lang bei 1700 x g drehen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Geschwindigkeit sowohl der Beschleunigung/Verzögerung auf die niedrigste Einstellung ändern, um den Gradienten beizubehalten (Abbildung 7C).
- Nach dem Schleudern die Röhren vorsichtig entfernen, ohne das Gefälle zu stören. Pipettieren Sie mit einer Pipettenpistole, die mit kaltem HBSS vorbenetzt ist (HBSS nach oben und unten pipettieren), die zwischen dem Dichtegradienten und HBSS gebildete Inselschicht (5–10 mL) in das neue 50-ml-Inselsammelröhrchen.
Anmerkung: Es ist hilfreich, die Pipette vor dem Pipettieren der Inseln mit kaltem HBSS zu befeuchten, um zu verhindern, dass die Inseln an den Innenwänden der Pipette kleben.
- Falls die Trennung unvollständig ist, wären die Inselzellen in der Dichtegradientenschicht sichtbar, pipettieren Sie die gesamten 10 mL des Dichtegradienten (untere Schicht) zusammen mit der an der Grenzfläche gebildeten Inselschicht heraus (nur um etwa 8–10 mL der HBSS-Deckschicht hinter sich zu lassen).
Anmerkung: Das Sammeln sowohl der Inselschicht als auch der Dichtegradientenschicht (untere Schicht) kann dazu führen, dass sich Schmutz ansammelt, was die Zeit für die Aufnahme von Inselzellen verlängern kann, aber es werden keine anderen Schritte geändert. Das Sammeln dieser beiden Schichten ist nicht erforderlich, wenn die Inselschicht gut gebildet ist.
- Geben Sie 20 mL eiskaltes HBSS in das neue 50-ml-Röhrchen mit den Inselzellen und zentrifugieren Sie dann 3 Minuten lang bei 350 x g in einer Schwingeimerzentrifuge.
- Nach dem Schleudern den Überstand vorsichtig herauspipettieren (nicht dekantieren) (~3 mL am Boden belassen), ohne das Pellet mit den Inselzellen am Boden zu stören. Entsorgen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie das Waschen und Zentrifugieren mindestens 3 Mal. Fügen Sie jedes Mal 20 ml HBSS hinzu und stellen Sie sicher, dass Sie das Pellet vor jeder Drehung suspendieren.
- Erwärmen Sie die komplette Medienflasche RPMI-1640 vor der Verwendung in einem Wasserbad bei 37 °C. Entfernen Sie nach der letzten Zentrifugation alle HBSS und geben Sie 4 ml des zuvor vorbereiteten vollständigen RPMI-1640-Mediums (enthält FBS, INS-1-Zellergänzungsmittel und Penicillin/Streptomycin) in das Pellet
.
- Lösen Sie das Pellet, indem Sie das Rohr vorsichtig schwenken, und gießen Sie das RPMI-1640-Medium sofort in eine 100-mm-Petrischale. Geben Sie weitere 5 ml RPMI-1640-Medium in das Röhrchen und schwenken Sie es vorsichtig, um alle verbleibenden Inselzellen abzuwaschen, und gießen Sie das Medium dann ebenfalls in dieselbe Petrischale.
- Entnehmen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer 20-μl-Pipette gesunde Inselzellen aus der Petrischale und legen Sie sie in eine neue Petrischale, die 10 ml des vollständigen RPMI 1640-Mediums enthält. Bei der Betrachtung unter dem Präpariermikroskop sollten die Inselzellen kugelig/länglich und goldbraun mit einer glatten Oberfläche erscheinen, verglichen mit dem relativ transparenten, feinen exokrinen Gewebe.
Anmerkung: Die Vergrößerung des Präpariermikroskops ist in der Regel auf 12,5–16x eingestellt. Der Ertrag der Inselzellen hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter Stamm, Alter und Geschlecht der Maus. Dieses Protokoll ergibt in der Regel 250–350 gesunde Inselzellen von gesunden C57BL/6J-Mäusen im Alter von 4–10 Monaten.
- Inkubieren Sie die Inselzellen über Nacht in einem sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 -Infusion und 95 % befeuchteter Luft für Experimente am nächsten Tag oder frieren Sie die Inselzellen für die gewünschte Analyse zu einem späteren Zeitpunkt ein.
- Sobald die Inselzellen eingefroren sind, können sie nicht mehr für Sekretionsassays verwendet werden, sondern nur für die RNA- oder Proteinquantifizierung. Um Zellen zum Einfrieren zu sammeln, legen Sie sie in HBSS-Puffer, sammeln Sie alle Inselzellen in 200–500 μl Puffer, geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen, zentrifugieren Sie 350 x g für 1–2 Minuten, entfernen Sie den Überstand und lassen Sie nicht mehr als 30–40 μl Lösung übrig, legen Sie sie für die kurzfristige Lagerung (mehrere Tage) bei -20 °C oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung.
