Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden: Eine Technik zur Analyse von Sphäroiden auf die Expression der intra- und extrazellulären Antigenexpression

Zusammenfassung

Quelle: Cavaco, A. C. M. et al. Ein 3D-Sphäroidmodell als physiologisches System für die Differenzierung und Invasion von Krebs-assoziierten Fibroblasten in vitro-Studien. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik der Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden, um die Differenzierung der Fibroblasten oder CAFs zu verstehen. Dieses Protokoll hilft beim Nachweis der Expression von intra- und extrazellulären Antigenen, einschließlich der Ablagerung von EZM-Proteinen in den Sphäroiden.

Protokoll

1. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden

1. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h in einem 1,5 mL Reaktionsröhrchen pro Versuchsbedingung oder pro zu analysierendem Protein. Legen Sie zum Beispiel die Sphäroide von iNFs, die mit TGF-β1 stimuliert wurden, in ein Röhrchen, das sich von den Kontroll-iNFs unterscheidet, die nicht behandelt wurden. Um einen Bruch der Sphäroide durch zu starke Scherkräfte zu vermeiden, schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Mindestens 5-10 Sphäroide in ein Reaktionsröhrchen geben, um Replikationen zu ermöglichen und mögliche Verluste während der Waschschritte zu berücksichtigen.
2. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Der methylcellulosehaltige Überstand wird vorsichtig durch Pipettieren entfernt, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
3. Mit 50 μL 1x PBS waschen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren, wie in 1.2 beschrieben.
4. Je nach zu färbendem Protein mit 50 μl 4%igem Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur (für αSMA, NG2 und Integrin α3β1) oder mit 50 μl Methanol für 10 min bei -20 °C (für Laminin-332-Untereinheiten) fixieren.
5. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben.
6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton-X in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
7. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
8. Inkubieren Sie die Sphäroide in PBS, die 5 % FBS und 2 % BSA enthalten, für 1 h bei RT, um unspezifische Proteininteraktionsstellen zu blockieren.
9. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 μl Primärantikörpern in PBS, 2,5 % FBS und 1 % BSA bei 4 °C über Nacht. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: anti-αSMA Cy-3 konjugiert und anti-NG2 bei 5 μg/ml; BM2 Anti-Laminin α3, 6F12 Anti-Laminin β3 und Anti-Laminin γ2 20 μg/ml.
10. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
11. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 μl Sekundärantikörpern in PBS, 2,5 % FBS und 1 % BSA bei RT für 90 min. Die folgenden verwendeten Sekundärantikörper waren: Alexa 488 Anti-Kaninchen und Anti-Maus (5 μg/ml).
12. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
13. Inkubieren Sie die Zellen mit 30 μl DAPI-Färbelösung für 4 min bei Raumtemperatur.
14. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben.
15. Legen Sie die Sphäroide mit einer Pasteurpipette aus Glas in einem Tropfen PBS auf einen Objektträger.
16. Bilden Sie die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung ab. Nehmen Sie unterschiedliche optische Querschnitte des Sphäroids an verschiedenen optischen Ebenen eines z-Stapels (15-20 Stapelebenen). Um die Lasereinstellungen am Mikroskop zu bestimmen, verwenden Sie ein Sphäroid, das aus Zellen besteht, die für das interessierende Antigen negativ sind, oder ein Sphäroid, das nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt ist. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für alle Stichproben, die verglichen werden.
17. Analysieren Sie die mikroskopischen Bilder mit der ImageJ-Software, wie sie zuvor veröffentlicht wurde. Die Schritte sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Bestimmen Sie als Hintergrund die integrierte Signaldichte einer zellfreien Region of Interest (ROI). Berechnen Sie die gesamte korrigierte Zellfluoreszenz (TCCF) wie
    TCCF = integrierte Signaldichte - (Fläche des ausgewählten Sphäroids x mittlere Fluoreszenz des Hintergrunds)
18. Bestimmen Sie die gesamte korrigierte Fluoreszenz (TCF) der Sphäroide, da die TCCF auf die Fläche des Sphäroids und die Anzahl der Stapel normiert ist.
    TCF = TCCF des Sphäroids / (Fläche der Sphäroide x Anzahl der Stapel)

Ergebnisse

Abbildung 1. Sequenzielle Schritte zur Quantifizierung der Immunfluoreszenzfärbung eines Proteins von Interesse in Sphäroiden unter Verwendung von ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	Nr. D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 Untereinheit Maus (monoklonal)			selbstgemacht
Albumin-Fraktion V - BSA	AppliChem	Nr. A1391
Alexa Fluor 488 Ziege (polyklonal) Anti-Maus	Invitrogen	Nr. A11029
Alexa Fluor 488 Ziege (polyklonal) Kaninchen	Invitrogen	Nr. A11034
Anti-Laminin γ2 Untereinheit Maus (monoklonal)	Santa Cruz	SC-28330
Tisch-Zentrifuge	Fisher Scientific	Tel.: 50-589-620	sprießen
BM2 Anti-Laminin α3 Untereinheit Maus (monoklonal)			Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Zentrifugenröhrchen 50 mL	Corning	Artikel-Nr.: 430290
Konfokales Mikroskop	Zeiss
DMEM (hoher Glukosegehalt 4,5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Primäre Pankreasfibroblasten des Menschen	PELOBiotech	Artikel-Nr.: PB-H-6201
Penicillin/Streptomycin	Gibco	Nr. 15140-122
Objektträger	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Paraformaldehyd	Riedel-de Haën	Nr. 16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS