Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden: Eine Technik zur Analyse von Sphäroiden auf die Expression der intra- und extrazellulären Antigenexpression

1. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden

1. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h in einem 1,5 mL Reaktionsröhrchen pro Versuchsbedingung oder pro zu analysierendem Protein. Legen Sie zum Beispiel die Sphäroide von iNFs, die mit TGF-β1 stimuliert wurden, in ein Röhrchen, das sich von den Kontroll-iNFs unterscheidet, die nicht behandelt wurden. Um einen Bruch der Sphäroide durch zu starke Scherkräfte zu vermeiden, schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu vergrößern. Mindestens 5-10 Sphäroide in ein Reaktionsröhrchen geben, um Replikationen zu ermöglichen und mögliche Verluste während der Waschschritte zu berücksichtigen.
2. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Der methylcellulosehaltige Überstand wird vorsichtig durch Pipettieren entfernt, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
3. Mit 50 μL 1x PBS waschen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren, wie in 1.2 beschrieben.
4. Je nach zu färbendem Protein mit 50 μl 4%igem Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur (für αSMA, NG2 und Integrin α3β1) oder mit 50 μl Methanol für 10 min bei -20 °C (für Laminin-332-Untereinheiten) fixieren.
5. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben.
6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton-X in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
7. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
8. Inkubieren Sie die Sphäroide in PBS, die 5 % FBS und 2 % BSA enthalten, für 1 h bei RT, um unspezifische Proteininteraktionsstellen zu blockieren.
9. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 μl Primärantikörpern in PBS, 2,5 % FBS und 1 % BSA bei 4 °C über Nacht. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: anti-αSMA Cy-3 konjugiert und anti-NG2 bei 5 μg/ml; BM2 Anti-Laminin α3, 6F12 Anti-Laminin β3 und Anti-Laminin γ2 20 μg/ml.
10. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
11. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 μl Sekundärantikörpern in PBS, 2,5 % FBS und 1 % BSA bei RT für 90 min. Die folgenden verwendeten Sekundärantikörper waren: Alexa 488 Anti-Kaninchen und Anti-Maus (5 μg/ml).
12. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben, dreimal.
13. Inkubieren Sie die Zellen mit 30 μl DAPI-Färbelösung für 4 min bei Raumtemperatur.
14. Wiederholen Sie den Waschschritt wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben.
15. Legen Sie die Sphäroide mit einer Pasteurpipette aus Glas in einem Tropfen PBS auf einen Objektträger.
16. Bilden Sie die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung ab. Nehmen Sie unterschiedliche optische Querschnitte des Sphäroids an verschiedenen optischen Ebenen eines z-Stapels (15-20 Stapelebenen). Um die Lasereinstellungen am Mikroskop zu bestimmen, verwenden Sie ein Sphäroid, das aus Zellen besteht, die für das interessierende Antigen negativ sind, oder ein Sphäroid, das nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt ist. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für alle Stichproben, die verglichen werden.
17. Analysieren Sie die mikroskopischen Bilder mit der ImageJ-Software, wie sie zuvor veröffentlicht wurde. Die Schritte sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Bestimmen Sie als Hintergrund die integrierte Signaldichte einer zellfreien Region of Interest (ROI). Berechnen Sie die gesamte korrigierte Zellfluoreszenz (TCCF) wie
    TCCF = integrierte Signaldichte - (Fläche des ausgewählten Sphäroids x mittlere Fluoreszenz des Hintergrunds)
18. Bestimmen Sie die gesamte korrigierte Fluoreszenz (TCF) der Sphäroide, da die TCCF auf die Fläche des Sphäroids und die Anzahl der Stapel normiert ist.
    TCF = TCCF des Sphäroids / (Fläche der Sphäroide x Anzahl der Stapel)

Abbildung 1. Sequenzielle Schritte zur Quantifizierung der Immunfluoreszenzfärbung eines Proteins von Interesse in Sphäroiden unter Verwendung von ImageJ. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.