Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung auf die Tumortransplantation
- Unterbringung von Tieren
- Beziehen Sie generische C57BL/6-Mäuse von einem kommerziellen Zuchtanbieter.
- Stubenmäuse (5) in einzelnen belüfteten Käfigen unter folgenden Bedingungen: Temperatur: 20–26 °C; Luftfeuchtigkeit 30–70%; Beleuchtungszyklus: 12 h hell und 12 h dunkel.
- Verwenden Sie Maiskolbeneinstreu, die wöchentlich gewechselt wird.
- Für die Diät ist während des gesamten Studienzeitraums strahlensterilisiertes Trockengranulatfutter bereitzustellen.
- Für Wasser geben Sie den Tieren freien Zugang zu sterilem Trinkwasser.
- Vorbereitung des Spendertumorfragments
- Beginnen Sie mit der Überwachung des Körpergewichts (BW) durch Wiegen mit einer Waage und des Tumorvolumens (TV) durch Messschiebermessung von tumortragenden Spendermäusen.
- Wenn der Fernseher 500–1.200 mm3 erreicht, euthanasieren Sie das Tier in einer Haube für biologische Gefährdung gemäß dem Protokoll.
- Sterilisieren Sie die Haut um den Tumor herum mit Jodophortupfern.
- Entfernen Sie den Tumor chirurgisch gemäß dem Protokoll.
- Untersuchen Sie vor der Beendigung visuell und durch Abtasten auf das Vorhandensein tastbarer Tumoren.
- Für den Abbruch euthanasieren Sie zuerst die Mäuse gemäß dem genehmigten Protokoll, öffnen Sie den Bauch und untersuchen Sie die Bauchspeicheldrüse visuell auf Tumore.
- Schneiden Sie den Tumor durch eine postmortale Operation ab und fügen Sie ihn dem kalten PBS hinzu. Alle Tiere werden in eine saubere, ungeladene, durchscheinende Euthanasiekammer mit einem speziellen Deckel mit einer Öffnung für die Abgabe des zu verwendenden Kohlendioxids gebracht.
- Das Gas wird mit einer Durchflussrate in die Kammer abgegeben, die eine schnelle Bewusstlosigkeit bei minimaler Belastung des Tieres hervorruft. Die optimale Durchflussmenge für CO2 sollte bei etwa 2–2,5 l/min liegen.
- Beobachten Sie jedes Tier während der Euthanasieprozedur visuell, um sicherzustellen, dass alle Tiere angemessene Gaskonzentrationen erhalten und während der Euthanasieprozedur nicht wieder das Bewusstsein erlangen.
- Halten Sie den Gasfluss nach dem offensichtlichen klinischen Tod mindestens 1 Minute lang aufrecht, um die Möglichkeit zu minimieren, dass sich ein Tier erholt (wenn es apnoisch, aber nicht tot ist).
- Entfernen Sie angrenzendes Nicht-Tumorgewebe. Gereinigter Tumor kann schnell fotografiert werden.
Legen Sie das Tumorgewebe in RPMI-1640 und halten Sie es vor der Dissoziation auf Eis.
Anmerkung: Tierkadaver werden in Säcken verpackt und in den entsprechenden Gefrierschrank gelagert, um auf ihre Entnahme zu warten.
- Legen Sie den Tumor in eine Petrischale, die 20 ml PBS enthält (kühlen Sie das Medium oder den Puffer auf 4 °C vor, bevor Sie die Tiere einschläfern).
- Wenn kontaminierendes Blut vorhanden ist, übertragen Sie den Tumor in eine andere Petrischale und waschen Sie den Tumor mit PBS.
- Schneiden Sie den Tumor in zwei Hälften und entfernen Sie überschüssige Haut, Gefäße, Verkalkungen und/oder Nekrosen.
- Wählen Sie nur intakte Tumorstücke aus und geben Sie sie in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 20 ml PBS hinzu und transportieren Sie das Röhrchen in einen separaten Tierraum für pharmakologische Studien.
>2. orthotope Implantation der Bauchspeicheldrüse
- Anästhesie und Analgesie
- Verwenden Sie eine 2-ml-Ketamin-Injektion und eine 0,42-ml-Xylazin-Injektion (20 mg/ml), gemischt mit 5,91 ml sterilem Injektionswasser oder Kochsalzlösung bei einem Dosisvolumen von 0,06–0,1 ml/20-25 g Körpergewicht.
HINWEIS: Gemäß dem Tierschutz ist eine Analgesie sowohl vor als auch nach der Operation erforderlich. 0,05–0,1 mg Buprenorphin /kg, SC. Die erste Dosis wird vor der Operation verabreicht und dann 3 mal alle 4 Stunden nach der Operation kontinuierlich dosiert.
- Chirurgischer Eingriff bei orthotoper Implantation
- Betäuben Sie Mäuse durch intramuskuläre Injektion (IM). Betäuben Sie das Empfängertier mit 5 % Isofluran, das durch einen Nasenkegel bei 1 % gehalten wird. Das Tier beginnt sich zu entspannen, verliert seinen Aufrichtreflex und wird schließlich unbeweglich. In dieser Narkosetiefe können sie leicht durch schmerzhafte Reize geweckt werden; Lassen Sie die Anästhesie tiefer werden, bis solche Reaktionen auf Schmerzen nicht mehr vorhanden sind.
- Nachdem die Tiere vollständig betäubt sind, fixieren Sie die Mäuse auf einem Versuchsbrett in der richtigen Seitenlage.
- Halten Sie die Mäuse in der richtigen Seitenlage. Desinfizieren Sie die Haut um die Milz mit Jod und entjoden Sie dann mit 75%igem Ethylalkohol.
- Finde den mittleren Punkt der Milz und mache einen 1 cm langen vertikalen Schnitt am Bauch, um die Milz freizulegen.
- Ziehen Sie einen Teil des Pankreasgewebes unter der Milz vorsichtig mit einer Flachpinzette heraus und nähen Sie ein Maus-Homotransplantat-Tumorstück aus der Samenmaus auf die Bauchspeicheldrüse der Empfängermaus mit 9-0 resorbierbarer chirurgischer Naht.
- Verschließen Sie den Bauch mit einer 6-0 Seidennaht durch eine Doppelnaht. Erreichen Sie Homöostase durch Kompression.
- Wenn nach Beendigung der Tumorimplantation weder Blutungen noch Tumorgewebeleckagen auftreten, halten Sie die Tiere in einem warmen Käfig.
- Überwachen Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Bringen Sie das Tier nach vollständiger Genesung von der Narkose in den Tierraum zurück. Überwachen Sie die tumortragenden Mäuse, indem Sie den Abdomen in der Nähe der Milz abtasten und die Mäuse mit orthotopen Tumoren auswählen.
>3. Gesundheitsüberwachung von tumortragenden Mäusen
- Überprüfen Sie täglich den Wasser- und Lebensmittelverbrauch.
- Untersuchen Sie das Aussehen der Maus auf ein ungepflegtes Haarkleid, Klumpen, Dünnheit, abnormalen Atem oder Aszites.
- Palpieren Sie den Bauch, um zu prüfen, ob es spontane Tumore an der Leber oder Milz gibt.
- Wiegen Sie die Mäuse wöchentlich mit einer Waage.
- Wenn eines der folgenden klinischen Symptome beobachtet wird, werden die Mäuse für die Probenentnahme und Autopsie getötet: BW-Verlust >20%); eingeschränkte Mobilität (nicht in der Lage zu essen oder zu trinken); Unfähigkeit, sich normal zu bewegen, aufgrund von signifikantem Aszites und vergrößertem Abdomen; Anstrengung bei der Atmung.
