Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegekomitee und dem Jove Veterinary Review Board überprüft.
1. IRE von SQ-Tumoren
- Bereiten Sie die erforderlichen Materialien vor: Rechteck-Elektroporator, Sicherheitsfußschalter, Elektroden (Nadelarray versus Pinzette) und Adapter. Bewahren Sie sterile Nähte (nicht resorbierbar 4-0), Alkoholtupfer, Haarschneider, Enthaarungscreme, Augenschmiermittel, Wattegaze, Buprenorphin und Anästhetika ebenfalls in der Nähe auf.
- Sterilisieren Sie die Pinzette oder die Nadelarray-Elektroden mit Gassterilisation. Autoklavieren wird nicht empfohlen. Verwenden Sie einen Glasperlensterilisator, um die Elektroden zwischen den Tieren zu sterilisieren.
- Befolgen Sie die Schritte, um eine Anästhesie bei Mäusen erfolgreich einzuleiten, sobald das SQ-Tumorimplantat einen Durchmesser von 5 mm erreicht hat. Kurz gesagt: Verabreichen Sie der Empfängermaus 0,05 - 1 mg/kg Buprenorphin-Analgetikum SQ, 30 Minuten vor der Operation. Anschließend werden die Empfängermäuse mit 2 - 3% Isofluran in Sauerstoff (2 l/min) mit einem Präzisionsverdampfer (oder anderen Anästhetika) betäubt. Halten Sie die Mäuse während des gesamten Eingriffs auf einem 37 °C warmen Heizkissen. Tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie anfangs keinen Schreckreflex haben, und bestätigen Sie die Anästhesie in der Operationsebene durch das Fehlen eines Pedalreflexes bis hin zu einem sanften Zehenklemmen. Halten Sie die Narkose während des gesamten chirurgischen Eingriffs aufrecht.
- Legen Sie die anästhesierte Maus auf die Seite, um Zugang zum SQ-Tumor an der Flanke zu erhalten. Entfernen Sie die Haare mit einer Haarschneidemaschine und reinigen Sie die Haut mit einem Alkoholtupfer.
- Verwenden Sie bei SQ-Tumoren 2-Nadel-Array-Elektroden. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette direkt unter der Tumorstelle an und führen Sie die Elektroden parallel zum Körper durch die Haut ein, wobei Sie darauf achten, dass sie nicht in die Bauchhöhle eindringen. Sobald Sie die Haut durchdrungen haben, positionieren Sie die Elektroden so, dass sie den Tumor umklammern.
- Programmieren Sie den Elektroporator so, dass er 100 μs Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz bei 1.500 V/cm für insgesamt 150 Impulse liefert. Geben Sie die Impulse mit dem Fußpedal ab. Trennen Sie jeden Satz von 10 Impulsen durch 10 s, um die Wärmeableitung zu ermöglichen und die korrekte Position der Elektroden zu bestätigen.
Anmerkung: Ohne den Einsatz von Lähmungsmitteln kommt es bei Mäusen zu Muskelkontraktionen mit IRE, die zu einer Verschiebung der Elektroden führen können, wenn sie nicht manuell gesichert werden.
- Entfernen Sie die Elektroden nach vollständiger Dosierung, die 200 s nicht überschreiten sollte. Notieren Sie die tatsächlich abgegebene Spannung, die auf dem Elektroporator angezeigt wird. Lassen Sie die Mäuse sich nach IRE in ihrem Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser erholen. Stellen Sie den Käfig auf ein Heizkissen, um die Genesung zu erleichtern. Überwachen Sie Vitalparameter wie Atmung, Durchblutung usw. während des Genesungsprozesses. Bestätigen Sie die Anzeichen eines Aufrichtungsreflexes, sobald sich die Maus erholt hat, und stellen Sie die Käfigdose wieder in die normale Haltung. Verabreichen Sie Buprenorphin 0,05 - 0,1 mg/kg 8 - 12 Stunden nach der Operation und alle 8 - 12 Stunden nach dem Eingriff, je nach Bedarf bei Anzeichen von Schmerzen.
2. IRE von orthotopen Tumoren
HINWEIS: Die IRE von orthotopen Tumoren beinhaltet eine zweite Überlebensoperation an derselben Maus und erfordert daher eine spezielle Genehmigung der lokalen IACUC, bevor begonnen wird.
- Bereiten Sie die erforderlichen Materialien vor: Autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente wie Scheren, Skalpelle, Nadeltreiber, spitze Pinzetten und Pinzetten mit flacher Spitze. Halten Sie auch Folgendes in der Nähe: sterile Nähte (resorbierbar 6-0 und nicht resorbierbar 4-0), Alkoholtupfer, Haarschneider, Enthaarungscreme, Augenschmiermittel, Baumwollgaze, 10%ige Povidon-Jodlösung, OP-Abdecktücher, Heizkissen, Rechteck-Elektroporator, Sicherheitsfußschalter, Elektroden und deren Adapter, Buprenorphin und Anästhetika.
- Beurteilen Sie die Mäuse auf orthotopes Tumorwachstum durch in vivo Biolumineszenz-Bildgebung. Verfolgen Sie das Tumorwachstum durch Bildgebung ab Tag 4 nach der orthotopen Implantation und führen Sie zweimal pro Woche eine Bildgebung durch. Am Tag der Bildgebung ist einer anästhesierten (2 - 3 % Isofluran in Sauerstoff (2 l/min)) Empfängermaus 10 Minuten vor der Bildgebung 30 mg/kg D-Luciferin zu verabreichen (intraperitoneale Injektion). Bild für Luziferase-Aktivität unter Verwendung der Lumineszenzeinstellung ohne Emissionsfilter für eine Belichtungszeit von mindestens 5 s in einem Lumineszenz-Imager mit autofluoreszenzfreiem Heiztisch und unter Beibehaltung der Anästhesie für die Mäuse.
Anmerkung: Die orthotopen Tumoren sind ideal für die IRE-Behandlung 8 bis 10 Tage nach der Implantation, wenn die Tumoren deutlich sichtbar und noch auf die Bauchspeicheldrüse beschränkt sind, wie auf den Luciferase-Lumineszenzbildern zu sehen ist
- Befolgen Sie die Schritte, um den implantierten Tumor zu lokalisieren. Kurz gesagt, verabreichen Sie der Empfängermaus 0,05 - 1 mg/kg Buprenorphin Analgetikum SQ, 30 Minuten vor der Operation. Betäuben Sie die Empfängermäuse mit 2 - 3% Isofluran in Sauerstoff (2 L/min) mit einem Präzisionsverdampfer (oder anderen Anästhetika). Halten Sie die Mäuse während des gesamten Eingriffs auf einem 37 °C warmen Heizkissen. Tragen Sie Gleitmittel auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Testen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie anfangs keinen Schreckreflex haben, und bestätigen Sie die Anästhesie in der Operationsebene durch das Fehlen eines Pedalreflexes bis hin zu einem sanften Zehenklemmen. Halten Sie die Narkose während des gesamten chirurgischen Eingriffs aufrecht. Legen Sie die Maus auf den Rücken und drehen Sie sie vorsichtig auf die rechte Seite, so dass die linke Seite des Bauches freiliegt. Entfernen Sie die Bauchhaare der Maus mit Enthaarungscreme und reinigen Sie sie mit Gaze, um sicherzustellen, dass nach dem Schnitt keine freien Haare in den Bauch gelangen. Bereiten Sie den linken Bauch für die Operation vor, indem Sie 3 Zyklen mit 10% Povidon-Jod verwenden, gefolgt von Alkoholtupfern zur Desinfektion der Haut. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 1,5 cm langen Quer- oder Schrägschnitt in die Haut, 1 cm links von der Mittellinie, unterhalb des Brustkorbs, leicht medial zur Milz. Verlängern Sie dann den Schnitt durch die Bauchmuskulatur und spiegeln Sie den darüber liegenden oberflächlichen Schnitt wider. Lokalisieren Sie die Milz mit einer flachen Pinzette und führen Sie sie vorsichtig aus der Bauchhöhle aus. Ziehen Sie die Milz mit einem sterilen Baumwollapplikator zurück und suchen Sie den Schwanz der Bauchspeicheldrüse, der an der Unterseite der Milz befestigt ist. Ziehe den Schwanz der Bauchspeicheldrüse mit einer flachen Pinzette seitlich zurück. Wenn der Tumor nicht leicht zu lokalisieren ist, verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um den Magen und die Milz sanft zu bewegen, um den Tumor zu identifizieren.
- Externalisieren Sie den Tumor mit einer stumpfen Pinzette und erfassen Sie den Tumor fest mit den Platinelektroden der Pinzette. Geben Sie die Elektroporationsimpulse, wie in Schritt 1.7 programmiert, mit dem Rechteck-Elektroporator in Sätzen von 10 Impulsen ab, die über den Fußschalter gesteuert werden.
- Halten Sie den Tumor mindestens 60 s nach der IRE externalisiert, um auf Anzeichen einer Blutung zu überwachen. Setzen Sie den Tumor wieder in die Bauchhöhle ein und schließen Sie den Schnitt wie beschrieben. Kurz gesagt, schließen Sie die Bauchmuskulatur mit einer resorbierbaren Naht 6-0 mit einem durchgehenden oder unterbrochenen Stich und schließen Sie die darüber liegende Haut mit einer nicht resorbierbaren unterbrochenen Naht 3-0 bis 6-0. Brechen Sie die Anästhesie zu diesem Zeitpunkt ab. Lassen Sie die Maus wiederherstellen, wie in 1.7 beschrieben. Überwachen Sie die Maus, bis sie wiederhergestellt ist.
- Überwachen Sie die Auswirkungen von IRE auf das Tumorwachstum mit Hilfe der In-vivo-Luziferase-Bildgebung gemäß Schritt 2.2.
