Magnetisch biogedruckte 3D-Sphäroid-Co-Kulturen: Eine Methode zur Co-Kultivierung von Krebszellen und Fibroblasten

Zusammenfassung

Quelle: Noel P. et al.Vorbereitung und metabolischer Assay von 3-dimensionalen sphäroiden Co-Kulturen von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und Fibroblasten. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video erklärt das 3D-magnetische Bioprinting von co-kultivierten Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und Fibroblasten. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und aktivierte Pankreasfibroblastenzellen werden unter dem Einfluss magnetischer Kräfte co-kultiviert und mit einer biokompatiblen Nanopartikelanordnung magnetisiert, um Sphäroide zu erzeugen.

Protokoll

1.Kultur von 3D-Sphäroiden von Bauchspeicheldrüsenkrebs mittels magnetischem Bioprinting

1. Unter Verwendung der standardmäßigen aseptischen Gewebekulturtechnik werden die interessierenden Zellen in einem T75-Kolben auf eine Konfluenz von 70-80 % in geeigneten Wachstumsmedien kultiviert.
   Anmerkung: Typischerweise wurden 5-7 × 10⁶ Zellen aus einem 70-80% konfluenten T75-Kolben geerntet. In dieser Studie wurden zwei verschiedene Zelltypen verwendet - Patu8902 (Pankreastumorzellen) und PS1-Zellen (aktivierte Pankreas-Sternzellen). Beide Zelllinien wurden in Roswell Park Memorial Institute media 1640 (RPMI-1640) kultiviert, ergänzt mit 10% (v/v) fötalem Rinderserum (FBS), 1× Penicillin-Streptomycin (p/s).
2. Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS).
3. Trennen Sie die Zellen von der Kunststoffoberfläche, indem Sie mit 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA für 5-10 min bei 37 °C trypsinisieren. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Mikroskop
.
4. Deaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe von 8 mL Wachstumsmedien zu abgelösten Zellen. Vermeiden Sie eine übermäßige Trypsinisierung, da dies die Gesundheit/Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann.
5. Pipettieren Sie Zellen nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen und die Zelldichte mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer zu zählen.
6. In der Zwischenzeit ein Fläschchen mit NS auf Umgebungstemperatur ausgleichen.
7. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Aussaat der gewünschten Anzahl von Sphäroiden (Wells) erforderlich sind, und aliquotieren Sie sie auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Um beispielsweise eine ganze 96-Well-Platte mit 5.000 Zellen/Well zu bepflanzen, aliquotieren Sie mindestens 5,5 × 10⁵ Zellen.
8. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 500 x g für 3 min entnommen. Der Überstand wird vorsichtig aspiert oder dekantiert und die Zellen werden in einem Gehalt von 1,0 x 10⁶ Zellen/ml in Wachstumsmedien resuspendiert. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um ein Scheren zu vermeiden. Resuspendieren Sie z. B. 5,5 x 10⁵ Zellen in 550 μl Wachstumsmedium.
9. Magnetisieren Sie die gewünschte Anzahl von Zellen mit dem äquilibrierten NS (Schritt 1.6).
   1. Geben Sie NS direkt zur Zellsuspension in Wachstumsmedien und rühren Sie vorsichtig um. Für eine effiziente magnetische Markierung von Zellen verwenden Sie 10 μl NS pro 100 μl Zellen (resuspendiert bei 1 x 10⁶ Zellen/ml).
      Anmerkung: Für ein typisches Experiment markieren Sie 5,5×10⁵ Patu8902 Zellen in 550 μl mit 55 μl NS und 1,1×10⁶ PS1 Zellen in 1100 μl (separat) mit 110 μl NS.
   2. Drehen Sie das Röhrchen einige Male vorsichtig um, um die Zellsuspension sicherzustellen. Übertragen Sie die Zell-NS-Mischung vorübergehend in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Führen Sie dies für jeden zu magnetisierenden Zelltyp separat durch. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter leichtem Schütteln, um die Bindung von NS an die Zelloberfläche zu ermöglichen.
      Anmerkung: Die Kultivierung und der Assay von Sphäroiden, die entweder von Patu8902- oder PS1-Zellen allein ausgehen, zusätzlich zu Co-Kultur-Sphäroiden, die mit beiden Zelltypen beginnen, die vor dem Drucken auf magnetischen Laufwerken vorgemischt wurden, wurde mit dieser Methode in unabhängigen Experimenten erfolgreich erreicht. Ein Verfahren zur Erzeugung von Co-Kultur-Sphäroiden aus Patu8902- und PS2-Zellen wird im Folgenden in den nachfolgenden Schritten beschrieben.
10. Pipettieren Sie die magnetisierten Zellen vorsichtig auf und ab, um sie gleichmäßig zu mischen, und bereiten Sie einen Mastermix mit der gewünschten Zellzahl vor. Verwenden Sie für die Aussaat von Sphäroiden insgesamt 15.000 Zellen (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) und stellen Sie sie auf ein Gesamtvolumen von 150 μl pro Well einer 96-Well-Platte ein.
    Anmerkung: Das endgültige Volumen, das in jede Vertiefung abgegeben wird, muss unabhängig von der Anzahl der verwendeten Zellen gleich sein.
11. Platzieren Sie eine zellabweisende 96-Well-Platte auf dem magnetischen 96-Well-Sphäroidantrieb und geben Sie 150 μl Zellmischung in jede Vertiefung ab. Beobachten Sie, wie sich die Zellen langsam in der Mitte der Vertiefung über dem Magneten sammeln. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht in einem 5 %_{CO 2} -Inkubator, der auf 37 °C eingestellt ist, wobei der magnetische Sphäroidantrieb noch angebracht ist. Entfernen Sie den Magnetstick und inkubieren Sie ihn für weiteres Wachstum bis zu 7 Tage.
    Anmerkung: Es ist wichtig, zellabweisende Wachstumsplatten für den Sphäroiddruck mit magnetischen Sphäroidantrieben zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass der Sphäroidantrieb mit dünneren kleineren Magneten und nicht der Halteantrieb verwendet wird.
12. Überwachen Sie täglich das Wachstum von Sphäroiden. Füllen Sie alle drei Tage frisches Wachstumsmedium auf, indem Sie die auf dem magnetischen Halteantrieb montierte Wachstumsplatte schräg platzieren und das verbrauchte Medium mit einer Mehrkanalpipette herausziehen.
    Anmerkung: Patu8902- und PS1-Zellen, die mit 15.000 Zellen/Well gemeinsam ausgesät werden, wachsen innerhalb von 5-7 Tagen zu 3D-Sphäroiden mit einem Durchmesser von 400-600 μm heran. Zu diesem Zeitpunkt sind Sphäroide bereit für die metabolische Charakterisierung, die Arzneimittelbewertung und andere nachgelagerte Anwendungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin EDTA	Sigma	Artikel-Nr.: 25300-054
96-Well-Platte für Zellabweisung	USA Scientific/ Griener Bio-One	Artikel-Nr.: 655970	Sphäroid-Wachstumsfuge
Cellometrie Objektträger zur Zellzählung	Nexcelom	CHT4-SD100-002
n3D Magnetischer Sphäroid-Antrieb	Nano3D-Biowissenschaften	655841	Teil des Spheroid Bioprinting Kits
n3D Magnetisches Sphäroid halten treiben	Nano3D-Biowissenschaften	655841	Teil des Spheroid Bioprinting Kits
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D-Biowissenschaften	655841	Teil des Sphäroid-Bioprinting-Kits: bei 4 °C lagern
Patu8902-Zellen	Labor-Bestand		duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse Zellen
PS1-Zellen	Labor-Bestand		aktivierte Sternzellen der Bauchspeicheldrüse
RPMI1640	Gibco	Artikel-Nr.: 11875-093	Wachstumsmedien für Zellen, Sphäroide