1. Metabolischer Assay von 3D-Pankreastumor-Sphäroiden für bioenergetische Signalwege mit dem Extracellular Flux Analyzer
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Analyse der metabolischen Funktionen der Sphäroide unter Verwendung eines extrazellulären Flussanalysators mit Assay-Mikrotiterplatten beschrieben, der speziell für 3D-Sphäroide entwickelt wurde.
- Waschen und Übertragen von Sphäroiden von Wachstumsplatten auf Sphäroid-Assay-Mikrotiterplatten.
Anmerkung: Sphäroide können für metabolische Assays verwendet werden, wenn sie einen Durchmesser von ~500 μm erreichen.
- Am Tag vor der Durchführung des Assays hydratisieren Sie die Sonde oder Sensorkartusche mit einem Assay-Kalibrant (200 μl/Well) in der mitgelieferten Utility-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht (4-18 h) in einem befeuchteten Inkubator (ohne CO2) bei 37 °C.
- Bereiten Sie das geeignete Testmedium für den gewünschten Stoffwechseltest vor, indem Sie das Basismedium (siehe Materialtabelle) entweder mit 2 mM L-Glutamin für den Glykolyse-Stresstest (GST) oder mit 1 mM Pyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM Glukose für einen mitochondrialen Stresstest (MST) Assay ergänzen.
Anmerkung: Der extrazelluläre Flussanalysator misst sowohl die mitochondriale Atmung (OCR) als auch die Glykolyse (ECAR) lebender Zellen in einem 96-Well-Plattenformat. Diese Raten geben einen Überblick über die zelluläre Stoffwechselfunktion in den untersuchten Proben. Detaillierte Anweisungen finden Sie im Handbuch in den Assay-Kits.
- Nach der Zugabe von assayspezifischen Zusätzen (siehe Schritt 1.1.1) erwärmen Sie das supplementierte Untersuchungsmedium in einem 37 °C warmen Wasserbad und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ± 0,1 mit 0,1 N NaOH ein. Halten Sie das Medium bis zum Gebrauch warm.
- Rekonstituieren Sie die Reagenzien des Assay-Kits im kalibrierten Testmedium auf die empfohlenen Stammkonzentrationen.
Anmerkung: Diese werden bei 10× der gewünschten Endkonzentration in den Vertiefungen hergestellt. Die Stammkonzentrationen für Glukose, Oligomycin und 2-Desoxyglukose (2-DG) betragen 100 mM, 100 μM bzw. 500 mM.
- Beobachten Sie Sphäroide in der Wachstumsfuge unter einem Lichtmikroskop, um die Morphologie der Sphäroide und die allgemeine Gleichmäßigkeit in Bezug auf die Form und Struktur der Sphäroide zu überprüfen.
- Übertragen Sie die Wachstumsfuge auf einen magnetischen Halteantrieb und saugen Sie vorsichtig ~120 μl Wachstumsmedium an. Waschen Sie die Sphäroide vorsichtig mit ~120 μl erwärmtem und vorkalibriertem Assay-Medium, aspirieren Sie und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Untersuchen Sie die Sphäroide erneut unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht weggespült werden.
- Bereiten Sie die Sphäroid-Assay-Mikroplatte vor, indem Sie 180 μl warmes Assay-Medium in jede Vertiefung geben.
- Stellen Sie eine P20-Mikropipette auf 10 μl ein und setzen Sie eine breite Spitze darauf ein. Wenn keine Spitzen mit breiter Bohrung verfügbar sind, schneiden Sie die Spitzen normaler Pipettenspitzen mit einer sauberen Schere oder einem Skalpell ab, um die Bohrung zu erweitern.
Anmerkung: Dies sollte die Scherung reduzieren und die Gesamtmorphologie der Sphäroide erhalten, während sie auf die Assay-Platten übertragen werden.
- Verwenden Sie eine warme (37 °C) Oberfläche, um die Sphäroide zu übertragen. Verwenden Sie eine Röntgenfilmbetrachteroberfläche, die mit einer Weißlichtlampe erwärmt wurde, um den Kontrast zu verbessern und die Visualisierung von Sphäroiden während des Übertragungsprozesses zu erleichtern.
- Aspirieren Sie vorsichtig ein einzelnes vorgewaschenes Sphäroid aus der zellabweisenden Wachstumsfuge mit einer P20-Mikropipette, die mit einer Spitze mit breiter Bohrung ausgestattet ist, und übertragen Sie das Sphäroid vorsichtig direkt in die Mitte jeder Vertiefung einer Sphäroid-Assayplatte, um den metabolischen Assay durchzuführen. Lassen Sie jedes Sphäroid durch reine Schwerkraft sanft in die zentrale Mikrokammer jedes Wells fallen, um die Assay-Platte zu bevölkern.
Anmerkung: Normalerweise dauert es 5-8 s, bis jedes Sphäroid durch die Schwerkraft in das Zentrum der Vertiefung fällt. Ziehen Sie die Pipette erst heraus, wenn sich die Sphäroide in der Mikrokammer abgesetzt haben. Legen Sie keine Sphäroide in die 4 Eckvertiefungen der Assay-Platte (A1, A12, H1, H12), da diese als Hintergrundvertiefungen verwendet werden.
- Überwachen Sie die Morphologie und Position jedes Sphäroids, um sicherzustellen, dass sich jedes Sphäroid in der Mitte jedes Wells befindet. Falls erforderlich, durch Absaugen des Sphäroids mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung und anschließender Abscheidung durch Schwerkraft in die Mitte der Vertiefung verlagert.
- Sobald alle Sphäroide übertragen wurden, stellen Sie die Assay-Platte eine Stunde vor dem Assay in einen 37 °C befeuchteten Luftinkubator (ohne CO2).
- Bestückung der Sensorkartusche mit Verbindungen und Durchführung des Assays
- Bereiten Sie 10 × konzentrierte assayspezifische Reagenzien in den in Schritt 1.1.2 beschriebenen assayspezifischen Medien vor. Um beispielsweise GST durchzuführen, rekonstituieren Sie Glukose, Oligomycin und 2-DG in den empfohlenen Volumina, auf die im Assay-Handbuch Bezug genommen wird. Sowohl die GST- als auch die MST-Assays wurden mit Patu8902-PS1-Sphäroiden durchgeführt.
- Richten Sie die Sensorkassette mit den Reihen A-H auf der linken Seite richtig aus und platzieren Sie eine Ladeführung auf der Sensorkassette. Stellen Sie sicher, dass der gewünschte Anschluss korrekt geladen wird, indem Sie die Ladeführung so ausrichten, dass sich der Buchstabe des zu ladenden Anschlusses in der oberen linken Ecke befindet.
- Mit einer Mehrkanalpipette können die Reagenzien direkt in die Injektionsöffnungen dosiert werden. Halten Sie die Ladeführungen während des gesamten Vorgangs mit den Fingerspitzen in Position.
Anmerkung: Jedes Reagenz wird in einen empfohlenen Port injiziert, der im Assay-Handbuch angegeben ist. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, aber klopfen Sie nicht auf einen Teil der Patrone, um Luftblasen zu entfernen.
- Entfernen Sie die Ladeführung und positionieren Sie sie auf Augenhöhe mit der Kartusche, um die Injektionsöffnungen visuell zu inspizieren und eine gleichmäßige Beladung zu gewährleisten.
- Erstellen Sie das experimentelle Assay-Design/Instrumentenprotokoll mit der Wave-Software des Instrumentencontrollers (im Folgenden Analysesoftware), wie in Abschnitt 1.3 beschrieben.
- Assay-Design und -Durchführung mit der Analysesoftware
- Erstellen einer Assay-Vorlage für das Experiment
- Öffnen Sie die Analysesoftware und klicken Sie auf "Vorlagen" oder wählen Sie aus einer vorhandenen Assay-Vorlage. Doppelklicken Sie auf "Leere Vorlage".
- Definieren Sie experimentelle Gruppen und Bedingungen.
- Definieren Sie Injektionsstrategien für die Ports A, B und C. Lassen Sie Port D leer.
Anmerkung: Für den GST-Assay werden nur diese Ports mit Glukose, Oligomycin und 2-DG beladen. Im Falle eines MST-Assays werden Oligomycin, FCCP und Rotenon geladen.
- Definieren Sie Vorbehandlungen, wenn Sphäroide mit einer oder mehreren Testverbindungen und der Kontrollgruppe behandelt wurden. Definieren Sie das Assay-Medium so, dass es Quelle, Ergänzungsmittel und andere Informationen enthält.
- Definieren Sie einen oder mehrere Zellentypen (z. B. Patu8902, PS1), in denen die Informationen zur Dichte und Durchgangsnummer angezeigt werden.
- Klicken Sie auf "Gruppen generieren".
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Plate Map" und weisen Sie der Assay-Platte Gruppen zu, die dem Versuchsdesign entsprechen.
- Wählen Sie die vier Eckwells als Hintergrundwells aus. Stellen Sie sicher, dass sich keine Sphäroide in diesen Vertiefungen befinden.
- Führen Sie den Assay auf dem Analysator durch
- Klicken Sie auf die Registerkarte Instrumentenprotokoll. Behalten Sie die Standardprotokollbefehle bei, indem Sie "Kalibrieren", "Äquilibrieren" und "Basismesszyklus" aktivieren.
- Klicken Sie auf "Injektionen" und definieren Sie die Verbindung für jeden Port. Bearbeiten Sie die Messzyklen von den standardmäßigen 3 Zyklen für Sphäroide auf 6 Zyklen. Behalten Sie die Standardwerte von 3 Minuten Mix, 0 Minuten Wartezeit und 3 Minuten Messzeiten bei.
Anmerkung: Die Standardzeiten für Mix-Wait-Measure betragen 3 Minuten, 0 Minuten bzw. 3 Minuten. Vor der Injektion der ersten Testsubstanz werden in der Regel drei Basalgeschwindigkeitsmessungen durchgeführt. Diese Messungen können gemäß dem Versuchsdesign kalibriert und nachjustiert werden.
- Überprüfungsprotokoll und Gruppenzusammenfassung.
- Speichern Sie die Assay-Designvorlage.
- Fahren Sie mit der Kalibrierung vor dem Assay fort, sobald die Injektionsanschlüsse mit den Assay-Substraten beladen wurden. Übertragen Sie die Kartusche mit der Utility-Platte in den extrazellulären Flussanalysator.
Anmerkung: Dies ist in der Regel innerhalb von 15-20 Minuten abgeschlossen und kalibriert die Sensoren, um OCR- und ECAR-Messungen durchzuführen.
- Ersetzen Sie nach der Kalibrierung der Kartusche die Utility-Platte durch die vorgewärmte Assay-Platte mit 3D-Sphäroiden und starten Sie den Assay. Nachdem die Messungen abgeschlossen sind, exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation oder eine Grafik- und Statistiksoftware, um die Daten zu analysieren.
