PDAC-Stammzellisolierung: Eine Methode zur Isolierung von Krebsstammzellen aus Bauchspeicheldrüsentumoren

Zusammenfassung

Quelle: Lonardo, E., et al. Untersuchung der Eigenschaften von Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien. J. Vis. Exp. (2015).

Dieser Artikel beschreibt die Technik zur Isolierung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Stammzellen (CSCs) aus menschlichem duktalem Adenokarzinom (PDAC)-Gewebe der Bauchspeicheldrüse. Diese CSCs werden verwendet, um die funktionellen Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung auf die In-vitro-Selbsterneuerungsfähigkeit von CSCs für die Entwicklung effizienterer Krebsbehandlungen zu untersuchen.

Protokoll

1. Isolierung von CSCs aus humanen PDAC (Abbildung 1)

1. In einer sterilen Biosicherheitswerkbank wird das humane PDAC-Gewebe in eine 60 x 15 mm große Kulturschale mit 1 ml steriler 1X-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt. Hacken Sie den Tumor mit einem sterilen Skalpell und einer Pinzette in kleine Stücke (1 - 5 mm).
2. Geben Sie 1 ml steriles 1X PBS in die Kulturschale und wiederholen Sie den Verreibungsschritt, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist, regelmäßig sind dafür 3-4 Runden erforderlich. Die Gewebesuspension (bis zu einem Endvolumen von 5 ml mit 1X PBS auffüllen) in ein steriles Röhrchen überführen und mit einem Dissoziator wie gentleMACS mechanisch homogenisieren.
3. Inkubieren Sie das homogenisierte Gewebe mit Kollagenase (verwenden Sie 2,5 mg/ml Kollagenase in 1X PBS) für 60 min bei 37°C und zentrifugieren Sie dann für 5 min bei 900 x g. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 10 ml vollständigem Medium. Die Zellsuspension durch ein 40 μm Sieb filtrieren und 5 min bei 900 x g zentrifugieren.
4. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 5 ml Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen (Ammoniumchlorid-Kalium, ACK) und inkubieren Sie das
5. Das Pellet in CSCs-Medium resuspendieren, auf eine mit Gelatine beschichtete Schale legen und 1 h bei 37 °C inkubieren. Dieser Schritt entfernt die meisten Fibroblastenzellen, die sich schnell an die Platte anheften.
6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator, entnehmen Sie vorsichtig die Zellsuspension und quantifizieren Sie die Anzahl lebensfähiger (trypanblau-negativer) Zellen mit einem Hämozytometer. Mischen Sie dazu die Suspension vorsichtig und pipettieren Sie 20 μl der Suspension in ein Eppendorf-Röhrchen. 20 μl (Verhältnis 1:1) Trypanblau zu den Zellen im Mikrozentrifugenröhrchen geben und gut vermischen. Pipettieren Sie etwa 10 μl der Mischung auf das Hämozytometer.
7. Zählen Sie alle klaren Zellen innerhalb der vier Eckquadranten der Zählkammer für die Zählung lebensfähiger Zellen.
   Anmerkung: Die Lebensfähigkeit und Ausbeute von Zellen kann zwischen Tumorproben erheblich variieren. Bei PDAC-Proben liegt die Lebensfähigkeit regelmäßig zwischen 45-70%, und Gewebestücke aus einer makroskopischen Tumorprobe mit einem Durchmesser von 3 - 5 mm sollten etwa 5x10⁶ lebensfähige Zellen ergeben.

Ergebnisse

Abbildung 1. Metformin zielt selektiv auf die CSCs ab.
(A) Metformin verringerte die Größe der Kugeln. Repräsentative Bilder von Kugeln, die nach der Behandlung mit den angegebenen Dosen von Metformin für 7 Tage erhalten wurden (rechtes Bild). Quantifizierung der Kugelgröße (n≥6) (linkes Bild), die angegebenen Zahlen in der Abszissenachse stellen den einzelne...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zählkammer/ Hämozytometer	Hausser Scientific Co	3200
CASY Zellzähler und Analysator für die Messung von Proliferation und Viabilität	Roche Innovatis	AG CASY Modell TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissoziator	Miltenyi Co	Tel.: 130-093-235
GentleMACS C Röhren	Miltenyi Co	Tel.: 130-093-237
100-mm-Gewebekulturschalen	BD Falke	353803
Sieb für Zellen	BD Falke	Artikel-Nr.: 352350
Konisches Röhrchen aus Polypropylen / 15 ml	BD Falke	352097
Konisches Röhrchen aus Polypropylen / 50 ml	BD Falke	Artikel-Nr.: 352070
1,5 ml sterile Röhrchen	Eppendorf	Tel.: 0030 120.086
50 ml Zentrifugenröhrchen	Corning	430828
Sterile Petrischale, 10 cm Schalen	Corning	353003
Kollagenase Typ IV	Technologien für Stammzellen	7909
RPMI Mittel 1640	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 11875-085
Penicillin/Streptomycin-Lösung, 100X	Lebenstechnologien	SV30010
L-Glutamin, 200 mM, 100X	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 25030-081
B27 Zuschlag 50x	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17504-044
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Sigma	Nr. F0291
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	Sigma	Nr. D8437
Steril 1x Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Sigma	Nr. D8537
Trypan-Blau	Lebenstechnologien	Tel.: 15250-061
Inkubator mit CO2-Eintrag
Mikro-Schere
Gebogene Pinzette
Splitterzange