Sphere Formation Assay: Eine In-vitro-Methode zur Identifizierung von Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs und Screening-Therapien

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Lonardo, E. et al. Untersuchung der Eigenschaften von Stammzellen von Bauchspeicheldrüsenkrebs zur Entwicklung neuer Behandlungsstrategien. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video zeigt das Protokoll zur Entwicklung von Pankreaskrebs-Stammzell-Sphäroiden in vitro. Der Assay kann als Screening-Instrument dienen, um Verbindungen zu identifizieren, die möglicherweise auf Krebsstammzellen abzielen.

Protokoll

>1.Kugelbildender Assay und Analyse

Kugelbildungsassay und Metformin-Behandlung
1. Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen und fügen Sie das entsprechende Volumen CSCs-Medium hinzu, um eine Zellkonzentration von 2.000 Zellen/ml herzustellen. Bewahren Sie die Zellsuspension nicht länger als 1 Stunde auf Eis auf und mischen Sie sie vor dem Plattieren gut an.
2. Geben Sie 500 μl 1X PBS zur Befeuchtung in die erste und letzte Reihe einer 24-Well-Platte, um die Verdunstung des Mediums zu minimieren. Die Zellen werden in Zellplatten mit extrem geringer Bindung mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Vertiefung in 1 ml Tumorkugelmedium (2.000 Zellen/ml) ausgesät.
  Anmerkung: Die Anzahl der Zellen, die für Assays zur Tumorkugelbildung verwendet werden, kann je nach Tumortyp variieren.
3. Behandeln Sie mindestens 4 Vertiefungen mit Vehikel (Negativkontrolle) und 4 Vertiefungen mit jeder zugewiesenen Behandlung, z. B. 3 mM Metformin. Stellen Sie die Zellen in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator und versorgen Sie die Zellen eine Woche lang mit 5 % CO₂.
  Anmerkung: Das Medium sollte nicht gewechselt werden, um eine ungestörte Bildung von Tumorkugeln zu ermöglichen, sondern kann täglich mit Wachstumsfaktoren nachgefüllt werden, da diese im Nährmedium nicht stabil sind.
4. Fügen Sie jeden zweiten Tag eine Behandlung hinzu, z. B. 3 mM Metformin oder Vehikel in jede der Vertiefungen. Bestimmen Sie die Anzahl der gebildeten Tumorkugeln nach 5 und/oder 7 Tagen mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers, der die Zählung größerer Strukturen ermöglicht (Abbildung 1).
  Anmerkung: Es sollten nur Tumorkugeln mit mindestens 40 μm in Betracht gezogen werden, die als klein (40 - 80 μm) bzw. groß (80 - 120 μm) kategorisiert werden können. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der Tumorkugeln dividiert durch die anfängliche Anzahl der ausgesäten Zellen (z. B. 2.000 Zellen) dargestellt werden.
Serielle Passage von Tumorsphären der ersten Generation
1. Nach 7 Tagen Inkubation werden die Tumorkugeln mit einem 40 μm Zellsieb entnommen und 5 min lang bei 900 x g bei RT zentrifugiert.
2. Dissoziieren Sie das Pellet der Tumorkugeln mit Trypsin zu einzelnen Zellen und expandieren Sie dann die erhaltene Einzelzellsuspension erneut für weitere 7 Tage.

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Die Metformin-Behandlung hemmt den Sauerstoffverbrauch und induziert die ROS-Produktion. (A) Metformin hemmt zusätzlich den Sauerstoffverbrauch (OCR) von aus Kugeln gewonnenen Zellen. Zwei verschiedene PDAC-Sekundärsphären wurden mit Metformin behandelt und OCR-Veränderungen wurden mittels extrazellulärer Flussanalyse gemessen. Die Rotenon-Injektion ...